miR-155通过靶向调控TGFBR1和TGFBR2抑制AMI诱导的心肌纤维化

黄仕美 汪元河 罗亚 杨小蓉 刘树馨 祝劲松

(贵州医科大学 1法医学院法医临床学教研室，贵州 贵阳 550004；2附属医院综合病房；3贵州中医药大学第一附属医院麻醉科)

急性心肌梗死(AMI)是引起心源性猝死的常见类型〔1〕。及时准确地确诊对AMI的治疗、预后及法医学鉴定有至关重要的作用。然而，到目前为止，AMI的诊断和治疗尚无有效的策略。

转化生长因子(TGF)-β/Smads信号通路心肌修复重要的调节因子，与AMI发生发展密切相关，Jin等〔2〕研究发现骨形态发生蛋白(BMP)-7通过拮抗TGF-β1信号通路减弱心肌纤维化，从而发挥心脏保护作用。TGF-β信号最初由其Ⅰ型和Ⅱ型跨膜受体(TGFBR1和TGFBR2)介导，TGF-β活化后与TGFBR2，TGFBR1结合形成异四聚体。当TGFBR1被激活，便将其所含带的信号转导给胞质区的信号传导分子Smads。Yang等〔3〕研究发现TGF-β信号转导相关基因TGFB1、TGFBR1、SNAI1和TWIST1的多态性与子宫内膜癌易感性相关。

微小RNA(miRNAs)是非编码RNA家族的一员，长度为18～25个核苷酸〔4〕，近年来，研究证实包括miR-378〔5〕、miR-184〔6〕、miR-214〔7〕等多种miRNA与心肌纤维化、AMI等多种心血管疾病病理生理进程有关。本研究旨在探讨miR-155对AMI小鼠心肌纤维化进程及心功能的影响及对心肌成纤维细胞(CFs)增殖和周期的调节，分析miR-155对TGFBR1/TGFBR2调控作用，阐明miR-155在AMI中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 C57/BL6小鼠由贵州医科大学动物实验中心提供，本研究中小鼠的处理均符合实验动物管理和使用委员会的要求与规定。CFs购自中国科学院上海细胞库，qRT-PCR试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白质分析试剂盒、电化学发光(ECL)检测试剂盒、TRIzol®试剂盒均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，LipofectamineTM2000购自Gibco公司，一抗TGFBR1、TGFBR2、内参GAPDH及辣根过氧化物酶标记的二抗购自Abcam 公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒和载体购自Promega公司，miR-155 mimic及其阴性对照购自吉玛公司。

1.2方法

1.2.1外周血采集 收集贵州医科大学附属医院收治的93例AMI患者，并选取50例同期的健康志愿者(对照组)。受试者均于清晨空腹状况下抽取外周静脉血约3 ml，置于含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝血管中，快速上下混合。所有样本经贵州医科大学医学伦理委员会批准，并签署知情同意书。

1.2.2细胞培养和转染 CFs细胞株使用含10%胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)培养基培养。待CFs生长至70%～90%融合时，按照转染试剂LipofectamineTM2000 试剂说明书对细胞进行转染。

1.2.3qRT-PCR检测 使用Trizol提取总RNA，采用逆转录试剂盒将提取的总RNA合成cDNA，按照qRT-PCR试剂盒说明书进行PCR，miR-155表达水平以U6为内参，TGFBR1，TGFBR2和NPPA的mRNA表达水平以GAPDH为内参，qRT-PCR结果以2-ΔΔCt值形式得到。

1.2.4双荧光素酶报告基因实验 通过TargetScan发现miR-155与TGFBR1和TGFBR2的3′-非编码区(UTR)的潜在结合位点，构建TGFBR1野生型(WT)3′-UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-WT-TGFBR1和突变型(Mut)报告基因质粒pMIR-Mut-TGFBR1，TGFBR2 WT报告基因质粒pMIR-WT-TGFBR2和Mut报告基因质粒pMIR-Mut-TGFBR2，将TGFBR1/TGFBR2 WT或Mut报告基因质粒与miR-NC，miR-155 mimic，NC-inhibitor或miR-155 inhibitor共转染进CFs。转染24 h后，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组的荧光素酶活性。

1.2.5Western印迹 用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解缓冲液提取各组CFs蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取上样缓冲液与样品混合并置于95℃变性10 min。蛋白样品以每孔50 μg加到10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，将蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后，5%脱脂奶粉的封闭缓冲液中，室温封闭2 h。将TGFBR1抗体(1∶500)，TGFBR2抗体(1∶500)，P-smad2抗体(1∶500)，P-smad3抗体(1∶500)和GAPDH抗体(1∶1 000)加入至PVDF膜，GAPDH为内参。4℃孵育过夜。加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记二抗1 h，ECL剂显色，暗室下显影。

1.2.6CCK8实验 以2 000个/孔的量将CFs接种到96孔板，按照CCK-8试剂盒制造商说明书，检测CFs增殖，在450 nm波长，测定每孔光密度值。

1.2.7流式细胞法 将对数生长期的CFs收集于5 ml离心管中，用0.01%胰蛋白酶消化30 min。用普通离心机100 r/min离心5 min后弃上清，再用预冷的PBS洗涤一次，100 r/min离心5 min后弃上清，收集细胞于同一5 ml流式离心管中，然后用4℃预冷的70%乙醇固定细胞1 h。去除乙醇后用PBS洗涤1次，用细胞染色液重悬细胞，并调整细胞密度为1×106个/ml，最后用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.8构建AMI小鼠模型 C57/BL6小鼠随机分为Sham组、AMI组、AMI+miR-155组各6只。AMI组小鼠用2%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉。胸骨左缘第2～4肋开胸，识别前降支走行范围，7/0滑线结扎左前降支，当结扎区域颜色转为苍白，心电图示波为AMI表现时确认模型构建成功。Sham组小鼠开胸但不结扎左冠状动脉。其余步骤同AMI组。AMI+miR-155组小鼠采用miR-155 mimic慢病毒进行心肌局部注射。

1.2.9小鼠心功能检测 10%水合氯醛腹腔注射对小鼠进行麻醉，然后心脏彩超检查各组小鼠并记录左室射血分数(LVEF)。

1.2.10Masson染色 小鼠心肌组织石蜡切片脱蜡至水，用苏木素染液染核10 min，充分水洗后用盐酸酒精分化，再蒸馏水洗。用Masson丽春红酸性复红液10 min。1%磷钼酸水溶液分化5 min，甩掉磷钼酸后直接用苯胺蓝染5 min。再依次用95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。

1.2.11天狼星红染色 小鼠心肌组织石蜡切片脱蜡水化，天狼星红染色液染色10 min，稍微冲洗后用Mayer苏木素染色液染色8 min，流水冲洗10 min。常规梯度乙醇进行脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1miR-155在AMI患者中表达降低 对照组血清中miR-155的相对表达量(1.00±0.12)显著高于AMI组(0.74±0.09；t=14.616，P<0.001)。

2.2miR-155对AMI小鼠左心室功能及纤维化的影响 AMI组miR-155表达量(0.34±0.09)明显低于Sham组(1.00±0.14，t=9.714，P<0.01)。AMI组LVEF明显低于Sham组，而AMI+ miR-155组LVEF明显高于AMI组(P<0.01)。AMI+miR-155组NPPA mRNA表达水平明显低于AMI组(P<0.01)。见表1。小鼠心肌组织Masson染色结果显示，AMI小鼠心肌组织中有大量胶原纤维沉积于心肌细胞间隙，而AMI+miR-155组小鼠心肌胶原纤维分布较AMI小鼠明显减少。天狼星红染色结果也显示，上调miR-155表达能抑制AMI小鼠心肌纤维化进程，见图1。

2.3TGFBR1和TGFBR2是miR-155的靶基因 在CFs中转染miR-155 mimic或inhibitor及各自阴性对照，在荧光显微镜下的观察结果显示，miR-155 mimic组中miR-155表达明显高于miR-NC组，而miR-155 inhibitor组中miR-155表达明显低于NC inhibitor组(P<0.01，图2)，表明转染成功。TargetScan筛选结果表明miR-155在TGFBR1的3′-UTR上具有潜在的结合位点，并且双荧光素酶试验结果显示，miR-155 mimic和pMIR-WT-TGFBR1共转染进CFs时，荧光素酶活性较miR-NC组明显降低(P<0.01)，而miR-155 inhibitor和pMIR-WT-TGFBR1共转染时，荧光素酶活性较NC inhibitor组明显升高(P<0.01)，但miR-155 mimic和inhibitor对pMIR-Mut-TGFBR1的荧光素酶活性均无明显影响。另一方面，通过上述实验发现miR-155也能特异性结合TGFBR2的3′-UTR，表明TGFBR2也是miR-155的靶基因。见表2。

表1 各组LVEF和NPPA mRNA比较

图1 miR-155对AMI小鼠左心室功能及纤维化的影响(×20)

图2 荧光显微镜观察CFs转染后miR-155的表达(×500)

表2 TargetScan和双荧光素酶报告基因试验验证TGFBR1、TGFBR2是miR-155的靶基因

2.4miR-155负性调控TGFBR1和TGFBR2表达 miR-155 mimic组中TGFBR1、TGFBR2 mRNA和蛋白表达均明显低于miR-NC组(P<0.01)，而miR-155 inhibitor组中TGFBR1、TGFBR2 mRNA和蛋白表达较NC inhibitor组明显升高(P<0.01)。见图3、表3。

2.5miR-155对CFs增殖和周期的影响 miR-155 mimic组OD值明显低于miR-NC组(P<0.01)，而miR-155 inhibitor组的OD值较NC inhibitor组明显升高(P<0.01)。转染miR-155 mimic能导致S期细胞比值较miR-NC组明显降低(P<0.01)，而转染miR-155 inhibitor则促进了细胞的S期阻滞(P<0.01)。见表3。

1～4：miR-NC组、miR-155 mimic组、NC inhibitor组、miR-155 inhibitor组图3 miR-155负性调控TGFBR1和TGFBR2的表达

表3 各组TGFBR1、TGFBR2 mRNA表达及CFs增殖及S期细胞比较

2.6miR-155通过调控Smad信号通路抑制EndMT 与NC组相比，在缺氧的刺激下，CFs中TGFBR1，TGFBR2，P-smad2和P-smad3表达明显升高，但转染miR-155 mimic能明显抑制TGFBR1和TGFBR2蛋白及smad2和smad3的磷酸化水平。但在共转染miR-155 mimic和TGFBR1/TGFBR2的细胞中，miR-155的调控效果会因TGFBR1/TGFBR2过表达而被逆转，图4、表4、表5。

1～4：NC组、Hypoxia组、Hypoxia+miR-155组、Hyporia+miR-155+TGFBR1/2组图4 Western印迹检测TGFBR1、TGFBR2、P-smad2和P-smad3的表达

表4 各组P-SMAD2、P-SMAD3、TGFBR1蛋白 表达

表5 各组P-SMAD2、P-SMAD3、TGFBR2蛋白 表达

3 讨 论

在AMI发病过程中，由于冠状动脉血流突然中断，导致供血区域的心肌细胞缺血缺氧坏死，继而引发一系列病理生理过程〔8〕。多种miRNAs证实为 AMI后重构或诱导血管生成的重要基因调控因子〔9，10〕。Ma等〔11〕研究表明，MiR-532-5p通过靶向PDCD4减轻缺氧诱导的心肌细胞凋亡；Fan等〔12〕发现过表达miRNA-210可刺激HGF表达，诱导改善左心室重构，从而改善心功能，促进梗死心肌的血管生成。虽然当前已报道了多种miRNA与心肌梗死的关系，但miR-155在AMI中的作用目前尚不清楚。本研究提示miR-155表达的异常变化可能与AMI有关。miR-155能改善AMI小鼠的左心室功能，对心肌纤维化具有抑制效果。

研究显示，TGF-β在可诱导CFs分化为肌成纤维细胞，TGFBR1和TGFBR2是TGF-β信号通路中的关键因子，TGF-β需通过与特异性受体TGFBR1，TGFBR2结合，才能发挥生物学作用〔13〕。在本研究结果表明miR-155能与TGFBR1和TGFBR2的3′-UTR特异性结合并负性调控两者的表达。

CFs的增殖能力是调控心肌纤维化过程的一个重要因素，过度增殖的CFs也能导致心肌纤维化的发生〔14〕。本研究结果表明上调miR-155表达能抑制细胞的增殖和S期阻滞，与之相反的是，下调miR-155表达能促进CFs的上述生物学行为。这提示miR-155可能抑制心肌纤维化发生。

内皮细胞转化(EndMT)与胚胎发生、损伤修复、组织新生、肿瘤进展和纤维化密切相关，EndMT可诱导成纤维细胞产生基质，从而加速心肌纤维化的进程，TGF-β1最近被证实是肾小管内皮细胞EndMT的重要触发因子〔15〕。研究表明缺氧等刺激因素可以诱导 EndMT过程〔16〕，发现在缺氧条件下，TGFBR1，TGFBR2，P-smad2和P-smad3表达明显升高，但过表达miR-155能抑制TGFBR1和TGFBR2蛋白及smad2和smad3的磷酸化水平。而值得注意的是，上调TGFBR1或TGFBR2表达均能逆转miR-155的调控效果。这表明miR-155能通过靶向调控TGFBR1和TGFBR2表达抑制Smad信号通路从而调节EndMT。

综上，miR-155异常低表达可能和AMI密切相关，上调其表达能抑制CFs的增殖和S期阻滞及AMI小鼠的心肌纤维化进程，并且miR-155是通过靶向调控TGFBR1和TGFBR2从而抑制EndMT，可能对AMI诱导的心肌纤维化具有抑制作用。