两种H7N9 流感病毒荧光RT-PCR 试剂盒的敏感性和特异性评价

冯肖肖，赵灵燕，刘 霞，黄 靖，陈伟良，董建斐，张 璐，徐 辉

（浙江省动物疫病预防控制中心，浙江杭州 310000）

2013 年我国首次报告人H7N9 流感病例[1-3]。2017 年初我国首次检测到对家禽呈高致病力的H7N9 流感病毒，其传播力强、致死率高，给国内养禽业造成了巨大经济损失[4-9]。2017 年秋季我国开始实施家禽H5 和H7 亚型流感全面免疫政策，有效防控了H7N9 流感的传播与流行。家禽H7N9 流感强制免疫效果和病原污染状况日常监测是H7N9 流感防控的重要工作内容[10-11]。目前，H7N9 流感日常监测和防控普遍采用商品化荧光RT-PCR 试剂盒。而市场上商品化的H7N9 流感病毒荧光RT-PCR 检测试剂盒种类众多，不同试剂盒的阴阳性临界点判定标准不同，导致临床检测结果存在较大差异。因此，本研究选择两种H7N9 流感病毒荧光RT-PCR 检测试剂盒，对50 份样品进行检测，采用TG-ROC 方法分析其敏感性和特异性，并用Kappa 一致性检验评估检测结果的一致性，综合评价其检测性能，为H7N9 流感病毒检测试剂盒的选择和应用提供依据和指导。

1 材料与方法

1.1 检测样品

浙江省在2016—2017 年日常监测中检出50份疑似H7N9 流感核酸阳性样品，已通过官方报备并送国家禽流感参考实验室，经国家禽流感参考实验室通过鸡胚病毒分离鉴定，确认其中11 份为H7N9 流感病毒阳性，其余39 份为阴性。

1.2 主要仪器与试剂

两种H7N9 流感病毒荧光RT-PCR 检测试剂盒分别购自A、B 两家生物科技有限公司，分别标记为A、B 试剂盒。A 和B 两种试剂盒提供的临界点判定值分别为43 和30。

Roche480 荧光定量PCR 仪、MagNA Pure 96全自动核酸提取仪，均购自Roche 公司。

1.3 荧光RT-PCR 检测

按照核酸提取试剂盒说明书提取样品核酸，分别用A、B 两种试剂盒进行H7N9 流感病毒核酸检测，结果判定依据试剂盒说明书标准。

1.4 数据统计与分析

统计分析两种荧光RT-PCR 检测试剂盒的检测结果，并以鸡胚病毒分离鉴定结果作为“金标准”，采用TG-ROC 分析方法筛选荧光RT-PCR最适Ct 值（阈值），以2×2 列联表分析两种检测试剂盒的敏感性和特异性。敏感性=真阳性数/（真阳性数+假阴性数）×100%；特异性=真阴性数/（真阴性数+假阳性数）×100%。对检测结果用Kappa 一致性检验评估其一致性，综合评价两种试剂盒的检测性能。其中，Kappa ＜0.2 说明一致性较差，0.2～0.4 说明一致性一般，0.4～0.6 说明一致性中等，0.6～0.8 说明一致性较强，0.8～1.0 说明一致性很强。

2 结果与分析

2.1 核酸检测

采用两种H7N9 流感病毒荧光RT-PCR 检测试剂盒分别对50 份拭子样品进行检测，按照试剂盒提供的临界点判定阈值。结果（表1、2）显示：A试剂盒检出27 份阳性、23 份阴性，以鸡胚病毒分离鉴定结果为“金标准”，则A 试剂盒的敏感性和特异性分别为90.9%（10/11）和56.4%（22/39），敏感性高，但特异性低；B 试剂盒共检出8 份阳性，其余42 份为阴性，以鸡胚病毒分离鉴定结果为“金标准”，则B 试剂盒的敏感性和特异性分别为54.5%（6/11）和94.9%（37/39），特异性高，但敏感性低。

表1 A 试剂盒与病毒分离鉴定法的检测结果比较 单位：份

表2 B 试剂盒与病毒分离鉴定法的检测结果比较 单位：份

2.2 一致性比较

Kappa 一致性检验结果（表3）显示：两种检测试剂盒的Kappa 值为0.28，一致性一般，说明A 和B 两种荧光RT-PCR 检测试剂盒对H7N9 流感病毒的检测结果差异较大。

表3 两种荧光RT-PCR 检测试剂盒的检测结果比较 单位：份

2.3 TG-ROC 分析曲线

敏感性和特异性相等时所对应的Ct 值为最佳阈值，这个点恰好是敏感性和特异性曲线的交点[12-14]。TG-ROC 分析曲线（图1）显示：A试剂盒阈值为33，对应的敏感性和特异性分别为90.91%和92.31%；B 试剂盒阈值为37，对应的敏感性和特异性分别为81.82%和87.18%。

图1 两种试剂盒TG-ROC 分析曲线

2.4 判定标准重设后检测

A 试剂盒原定的判定标准（Ct）为43，该阈值下的敏感性达到最高，但特异性较差。若将判定标准调整至33～35，其敏感性不变，但特异性大大提高。因此，根据TG-ROC 分析曲线，重新设定A 试剂盒判定标准为33。调整后的检测结果（表4）显示，与“金标准”相对比，A 试剂盒的敏感性和特异性分别为90.91%（10/11）和92.31%（36/39），均达到90%以上，与调整前相比，敏感性不变，但特异性提高了35.91 百分点。

表4 A 试剂盒调整判定标准后的检测结果对比 单位：份

B 试剂盒原定的判定标准（Ct）为30，该阈值下的特异性较高，但敏感性较差。若将临界点调整至36～37，不仅特异性保持较好，且敏感性大大提高。因此，根据TG-ROC 分析曲线，重新设定B 试剂盒判定标准为37。调整后检测结果（表5）显示，与“金标准”相对比，B 试剂盒的敏感性和特异性分别为81.82%（9/11）和87.18%（34/39），均在80%以上。与调整前相比，特异性虽然下降7.72 百分点，但敏感性提高了27.32 百分点。

表5 B 试剂盒调整判定标准后的检测结果对比 单位：份

2.5 判定标准重设后检测结果一致性

调整判定标准后两种试剂盒检测一致性比较结果（表6）显示，两种检测试剂盒的Kappa 值为0.85，一致性很强，说明两种试剂盒检测结果一致。

表6 两种试剂盒调整判定标准后检测结果一致性比较 单位：份

3 讨论

高致病性H7N9 流感是我国重点防控的人兽共患传染病之一[2-3，5]。H7N9 流感病毒属于RNA病毒，极易发生基因突变和重组，因此病原变异监视是防控高致病性禽流感的重要工作。目前，荧光RT-PCR 检测技术是H7N9 流感病原检测的常用方法之一[10，15]，可实时、快速地监视其分布和流行情况，在高致病性禽流感防控监测工作中得到广泛应用。不同厂家的H7N9 流感病毒荧光RT-PCR 检测试剂盒判定标准不同，导致其最终检测结果也不一致。因此，在实际应用中，应根据不同监测目的和要求，选择不同敏感性和特异性的试剂盒。ROC曲线，也称受试者工作特征曲线，最初运用在军事上，1971 年被推广到医学界后得到广泛应用，主要用于诊断试验的综合评价[12-13]。1995 年德国学者首次对ROC 曲线进行改进，并提出TG-ROC 分析方法，也称双图受试者工作特征曲线[12]。通过计算诊断试剂每个阈值对应的敏感性和特异性，以阈值为横坐标，敏感性和特异性为纵坐标，在同一个坐标系上绘制敏感性曲线和特异性曲线双图，其交点即为最佳阈值。TG-ROC 分析方法不仅可直观地反映敏感性和特异性对阈值的影响，也可估计试验结果准确度，还可以根据实际情况，选取最佳阈值作为判定标准，使试验的敏感性和特异性达到实际要求，以获得检测试验的最大准确度，因而常用来评价检测试验的可靠性，具有临床指导意义[13]。

本研究发现，两个厂家的H7N9 流感病毒荧光RT-PCR 检测试剂盒的判定阈值不同，因而其敏感性和特异性也各不相同，导致检测结果不一致。在实际应用中两种试剂盒各有利弊：A 试剂盒敏感性较高，可以有效检测病原，降低漏检对防控造成的不利影响，但其特异性低，误诊率较高，实际应用中会导致假阳性较多，导致因疫情误判而加大防控成本；而B 试剂盒特异性较高，可降低误诊引起的经济损失，但其敏感性低，难以有效检测禽群中存在的H7N9 流感病毒，实际应用中会导致假阴性较多，漏检率较高，可能造成防控漏洞而增加疫情发生风险。因此，在临床应用中，应根据不同需求和检测目的选择合适的试剂盒。

诊断试验中，恰当的判定阈值可提高诊断的真实性，提高疫病防控能力，还可以防范漏检、误诊带来的危害。TG-ROC 分析结果显示，在原定阈值下，A、B 两种试剂盒只能满足敏感性高或特异性高之一的特性，而不能同时达到最佳敏感性和特异性要求，不利于实际应用和选择。A、B 两个试剂盒的判定阈值偏低或偏高，致使假阳性或假阴性偏多，容易造成误判或漏检，不仅会加大诊断处理成本或疫情风险，还会降低诊断试剂的综合性能。通过TG-ROC 分析法计算诊断试剂的最佳阈值并重新调整后，A 试剂盒的敏感性和特异性同时达到90%以上，B 试剂盒能同时达到80%以上，且两者检测结果的一致性明显增强。这表明，判定阈值会影响诊断试验的可靠性和真实性。采用TG-ROC分析方法，选择适当的判定阈值，可以提高检测试剂的敏感性和特异性，增加检测结果的可靠性和真实性，减少漏诊和误诊带来的问题，从而帮助采取科学的疫病防控措施。

综上所述，不同厂家试剂盒的检测结果存在差异，实际应用中不同监测目的要求的试剂盒敏感性和特异性也不同，因此可以应用TG-ROC 分析方法，选定检测试剂盒的阴阳性临界点，重新调整试剂盒判定标准，提高检测方法在临床检测应用中的指导性。本试验样本数据有限，今后还需进一步积累数据进行深入研究。