自噬调控衰老分子机制的研究进展

李娇 袁硕 张庆镐，2

(1延边大学医学院免疫学教研室，吉林 延吉 133022；2大连大学医学院慢性病研究中心)

老龄化被描述为一种随时间变化的损伤积累、功能下降和环境适应困难，并伴随着发病率和死亡率的增加〔1〕。衰老及抗衰老的研究一直是世界医学领域的前沿课题，在不同的真核生物中，衰老是由受损的大分子和细胞器的逐渐累积驱动的〔1，2〕，是癌症、糖尿病、骨骼肌减少症、心血管和神经退行性疾病等疾病的主要危险因素〔1〕。对衰老机制的研究将有助于人们了解衰老的发生，找到预防和治疗衰老和年龄相关疾病的方法。

1 自 噬

自噬是真核细胞的主要降解过程，是一种由自噬相关蛋白(ATG)驱动的进化高度保守的机制〔3〕。自噬主要有3种类型：小自噬、分子伴侣介导的自噬(CMA)和大自噬(主要的自噬形式)，可分为3个阶段：起始、形成和降解〔3，4〕。隔离膜的形成是自噬体形成的关键步骤，受多种信号机制调控，吞噬区域或所选择的底物隔离使其伸长并成熟为自噬体，即双膜囊泡，随后通过运输与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。细胞质的自噬降解主要体现在两个方面：提供大分子化合物(溶酶体降解的产物，包括氨基酸和脂肪酸)作为饥饿期间细胞的替代能源；消除受损的大分子和细胞器，从而有助于细胞的清除〔4〕。自噬涉及细胞对各种应激条件的反应，如缺氧或高温时，迅速重组细胞功能；在细胞生长、增殖和生存及防御细胞内微生物等方面也有重要作用。癌症、神经退行性疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病)、脑卒中、肌少症、感染和心脏病等疾病的发作均与自噬受损有关〔3～5〕。然而在体内的肿瘤微环境中，过度激活自噬被认为在促进肿瘤生长中发挥重要作用，其有助于抵抗化疗和代谢变化，维持肿瘤细胞在应急状态下的生存〔6〕。

2 自噬与衰老的关系

在动物模型中，随着年龄的增长，自噬功能下降及随之而来的蛋白稳态继发性衰减和蛋白毒性的累积〔7，8〕。在秀丽隐杆线虫中，包括肠和神经元在内的各种组织的自噬通量水平普遍下降〔7〕；在哺乳动物中也观察到类似的功能下降，例如，对衰老小鼠肝脏的电镜分析显示自噬囊泡(AVs)形成率下降〔8〕。Levine组是第一个证实在长寿突变模型中抑制自噬，可以使突变体促进长寿的功能丧失〔9〕。与野生型相比，daf-2基因发生功能缺失突变的秀丽隐杆线虫寿命明显延长，而敲掉自噬相关基因Atg6后，daf-2突变体的寿命明显缩短，这表明自噬在延长寿命中起关键作用〔9〕。一些研究小组评估了过度表达自噬基因带来的影响，Atg5过表达降低了黑色素瘤细胞的增殖、延缓衰老的进展〔10〕。研究人员生成了在beclin1中靶向Phe121Ala突变的小鼠，其减少了beclin1与负调节因子B淋巴细胞瘤-2基因(BCL)2的相互作用，即有较高水平的基础自噬通量，该小鼠的健康寿命得到了明显的改善；此外，缺乏抗衰老蛋白klotho的小鼠增加了beclin1和BCL2的相互作用，降低了自噬〔11〕。因此，破坏beclin1-BCL2复合物是增加哺乳动物自噬、防止过早衰老、改善健康寿命和延长寿命的有效机制〔11〕。

基因组不稳定性、端粒缩短、表观遗传学改变、蛋白内稳态丧失、营养感应失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞丧失和细胞间通讯的改变是老化的主要特征〔1〕。值得注意的是，自噬已被证明几乎与这些特征均密切相关，自噬可以通过减少DNA损伤产生的活性氧(ROS)生成和促进DNA修复蛋白的循环来缓解基因组不稳定性的影响〔12〕。尽管自噬不能恢复或停止端粒的损耗，但研究表明，端粒功能障碍直接刺激自噬，促进癌前细胞的死亡〔13〕。自噬被认为与表观遗传改变没有直接关系，但它在维持蛋白质稳定〔14〕、营养感应〔15〕和通过线粒体自噬维持线粒体健康〔16〕方面均有重要意义。自噬与衰老之间的关系复杂需要进一步的探讨，但自噬已被证明在维护干细胞中起着至关重要的作用〔17〕。自噬还可以通过调控吞噬活性和炎症水平维持适当的免疫功能(细胞间通讯的关键组成部分)〔18〕。综上，自噬水平升高可以延缓衰老。在自噬调控衰老的过程中，胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路(IIS)、哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)信号通路、单磷酸腺苷(AMP)依赖的蛋白激酶(AMPK)信号通路和Sirtuin通路发挥了重要作用〔1〕。

2.1胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF)-1信号通路(IIS) 从酵母到哺乳动物，胰岛素/IGF-1信号通路(IIS)高度保守，在机体的代谢、营养感应、繁殖和衰老等方面起着重要作用，是研究最多的通路之一，也是第一个被证实能够影响衰老的通路〔1，19〕。AGE-1和daf-2是IIS的两个关键上游组成部分，它们可以调节各个生理方面。胰岛素或胰岛素样肽与其膜受体(胰岛素/IGF-1受体)相互作用时，受体被自身磷酸化并通过磷酸化激活其底物(IRS/CHICO/IST-1)，进而激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，PI3K将磷脂酰脂醇二磷酸(PIP)2转换为PIP3，蛋白激酶B(AKT)被磷酸化并激活，导致IIS被激活〔19〕。衰老与自噬活性水平的降低有关，而自噬活性的降低部分是IIS调节失调的结果，研究表明IIS通路的激活可以通过AKT激活mTORC1和(或)抑制叉头框蛋白(Fox)O信号来抑制自噬〔19，20〕。秀丽隐杆线虫的daf-2是表达胰岛素受体家族的唯一成员，可以影响生殖和细胞生长，而daf-2的这两种功能依赖于某些自噬基因的活性，自噬机制似乎在daf-2的下游发挥作用，daf-2(-)与野生型蠕虫相比，daf-2(-)突变体的自噬活性明显增强，线虫的寿命延长了两倍以上〔21〕。在哺乳动物中，胰岛素/IGF-1受体通过激活一系列保守激酶抑制FOXO转录因子DAF-16，而FOXOs转录因子是应激反应、代谢、细胞周期和生存的重要调节因子。在营养剥夺(和抑制IIS)条件下，FOXO可以促进几种自噬相关基因(例如，LC3、beclin1等)的转录，上调自噬水平，诱导多种细胞类型的蛋白降解〔20〕。热休克因子(HSF)-1也是IIS下游关键的转录因子，研究发现HSF-1可以介导TOR信号通路下游核糖体S6激酶(S6K)的突变导致自噬水平升高从而引起秀丽隐杆线虫寿命的延长〔19〕。在线虫模型研究中，芦丁(Rutin)通过胰岛素/IGF-1 (IIS)/DAF-16/FoxO信号通路诱导抗氧化防御和伴侣蛋白，增加自噬活性，并可能延缓衰老和年龄相关疾病的发生〔22〕。这些研究结果提示，抑制IIS信号通路可以诱导自噬水平升高，从而延缓衰老。

2.2mTOR信号通路 mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是调节细胞生长、增殖、存活和自噬等上游通路的汇合点〔23〕。细胞内存在mTORC1和mTORC2两个不同的复合物，它们由不同的蛋白集合体组成，表现不同的细胞功能〔23〕。mTORC2调节细胞存活和细胞骨架，并且可以磷酸化AKT，导致mTORC1的激活，也可以通过PI3K-AKT途径，磷酸化并失活结节性硬化症复合物(TSC)1/2，从而激活Rheb(mTOR活化所必需的刺激蛋白)，进而激活mTORC1，此外，由于mTORC2通过磷酸化和灭活Ⅱa类组蛋白脱乙酰基酶来促进FOXO1和FOXO3向细胞质迁移，抑制其在核内积累，使其失活，因此mTOR途径可以负面调节FOXO〔22，23〕。研究表明，蛋氨酸代谢物(同型半胱氨酸)可以激活mTORC1，而同型半胱氨酸随着年龄的增长而不断累积〔24〕，这可以表明衰老与mTORC1活性呈正相关。因此，mTORC1活性的增加是自噬活性随年龄增长而普遍下降的一个原因。自噬激酶(ULK)1-Atg13-FIP200复合物作为mTORC1的直接靶点，也是自噬的重要启动子，在营养丰富的条件下，mTORC1通过与该复合物的直接相互作用抑制自噬，介导磷酸化依赖抑制Atg13和ULK1的激酶活性；在饥饿条件下或雷帕霉素治疗下，mTOR从复合物中解离，导致ULK1的去磷酸化依赖性激活、ULK1介导的Atg13、FIP200和ULK1自身的磷酸化，从而触发自噬；mTORC1还可以通过刺激活化下游的翻译起始因子4E结合蛋白(4E-BP1)和S6K调控细胞生长，抑制细胞自噬〔23，25〕。与前面描述的daf-2突变一样，秀丽隐杆线虫中TOR信号的失活也会导致自噬水平的升高，也表现为寿命延长两倍以上〔20，25〕。TOR活性降低可延长多种生物模型(如酵母、果蝇、线虫、啮齿动物)的寿命，而且研究发现老年小鼠下丘脑的mTOR活动增加，容易促进老年肥胖。而雷帕霉素作为经典的mTOR抑制剂，通过激活自噬，可以显著改善衰老的这些效应〔23〕。在延龄草总皂甙(TTM)的干预下，发现TTM通过上调Rheb、下调mTOR，可以改善D-半乳糖致衰老大鼠的学习记忆能力，挽救自噬功能障碍，发挥抗衰老作用〔26〕。这些研究结果提示，抑制mTOR的信号转导可以诱导自噬水平升高，从而延缓衰老。

2.3AMPK信号通路 AMPK是一种进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内AMP/三磷酸腺苷(ATP)比率变化的能量传感器，也被认为是脂类的糖原代谢的主要调节因子，AMPK在衰老的研究中具有重要性〔27〕。多项研究表明，衰老对AMPK活性有较强的抑制作用，AMPK活性与寿命呈正相关。与野生型蠕虫相比，缺乏AMPK的秀丽隐杆线虫寿命减少了12%，而AMPK过表达则导致寿命增加了13%〔28〕。在AMPK下游，过氧化物酶体增殖物激活受体γ-辅激活因子(PGC)-1α可以调节抗氧化基因以应对氧化应激，AMPK活性降低可增加线粒体ROS并导致早衰〔29〕。AMPK是自噬的有力启动子。在饥饿、缺血、缺氧和代谢产物积累等因素作用下，AMP/ATP的比值升高，导致AMPK激活，增加细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+水平，从而激活沉默调节蛋白(SIRT)1诱导自噬的升高，SIRT1也可通过去乙酰化肝激酶(LK)B1中的赖氨酸残基，促进其从细胞核转移至细胞质，催化AMPK磷酸化和激活〔27〕。此外，AMPK可以通过磷酸化和激活自噬起始激酶ULK1来促进自噬，AMPK也可以通过磷酸化mTORC1、ULK1和PIK3C3/VPS34复合物中的自噬相关蛋白直接促进自噬，或通过磷酸化TSC2、调节转录因子下游的自噬相关基因(如FOXO3、TFEB和BRD4)的表达等方式间接促进自噬〔30〕。最新研究表明，越桔花青素(BA)通过AMPK-mTOR信号途径诱导自噬，进而降低衰老诱导的氧化应激，延缓衰老〔31〕。在秀丽隐杆线虫模型中，水杨酸和乙酰水杨酸通过激活AMPK和叉头转录因子DAF-16/FOXO可以激活自噬从而延长蠕虫的寿命〔32〕。这些研究结果提示，激活AMPK信号通路可以诱导自噬水平升高，从而延缓衰老。

2.4Sirtuins Sirtuins是一类NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶，包括Sirt1-Sirt7共7个成员，在进化中高度保守〔33〕。在调节多种细胞过程，如细胞代谢、线粒体稳态、自噬、DNA修复、凋亡、氧化/抗氧化平衡和衰老等方面具有重要作用，其活性的增加被证明与酵母、果蝇、蠕虫和哺乳动物的寿命延长有关〔33〕。哺乳动物和人体组织(包括肝脏、心脏、肾脏、大脑和肺)中SIRT1的蛋白和转录水平随年龄增长而普遍下降〔34〕。多项体内外研究表明SIRT1在老化血管组织中的表达明显下调，内皮细胞(ECs)、血管平滑肌细胞(VSMCs)和巨噬细胞中SIRT1的缺失加速了血管的老化〔35〕。与对照组相比，哺乳动物大脑特异性表达SIRT1可显著延长小鼠的寿命(雌性小鼠约16%，雄性小鼠约9%)〔36〕。激活SIRT1还能抑制紫外线照射引起的皮肤成纤维细胞老化〔37〕。SIRT1被证实与自噬相关基因(Atg5、Atg7、Atg8和LC3)有关，促进自噬小体的形成，从而提高细胞的自噬水平〔33〕。SIRT1可以通过与TSC2相互作用，负调控mTOR信号通路恢复氧化应激诱导的自噬损伤，从而提高胚胎干细胞的存活率，SIRT1也可以通过去乙酰化并激活FOXO3，它是IIS和mTOR通路的下游效应器，参与损伤线粒体的自噬清除和线粒体的修复〔34〕。研究表明，Sitr1-/-成纤维细胞在饥饿状态下可以导致自噬关键蛋白的乙酰化增强从而抑制自噬〔38〕。尿凝素A可能通过激活miR-34a介导的SIRT1/mTOR信号通路诱导自噬水平升高发挥神经保护作用，并可能有助于阻止D-半乳糖诱导的脑老化〔39〕。上述研究结果提示，增加SIRT1的表达可以诱导自噬水平升高，从而延缓衰老。

综上，衰老是由受损的大分子和细胞器的逐渐累积驱动的，自噬被证明在健康跨度和寿命延长中发挥关键作用，自噬水平升高可以延缓衰老。IIS、mTOR、AMPK和Sirtuins信号通路是影响衰老速度的主要调节途径，它们的调节被证明可以延长寿命，并且自噬可能是这些途径的必要中介(如图1所示)。基于这些数据我们希望能重新使用药物、联合用药或开发新的药物或基因干预来延缓衰老的进展。此外，自噬还与氧化应激、炎症、凋亡等密切相关，为研究抗衰老提供了更广泛的思路。

图1 自噬调控衰老的分子机制