不同品系昆虫病原线虫抗逆性分析

马 娟，郭笑笑，李秀花，王容燕，高 波，陈书龙

（河北省农林科学院植物保护研究所/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心/农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室，保定 071000）

昆虫病原线虫（entomopathogenic nematodes，EPNs）可以寄生昆虫，其中的斯氏属Steinernema和异小杆属Heterorhabditis线虫对地下害虫[1,2]和一些钻蛀性害虫[3]都具有较好的防治效果，是一类新型高效生物杀虫剂。昆虫病原线虫可以主动搜寻寄主，具有杀虫范围广、易于人工培养、使用安全等优点[4]。昆虫病原线虫还可以与化学农药混用，在一些区域是可替代化学杀虫剂的环境友好型生防因子，已在世界上很多地区进行了商业化生产和销售[5,6]。昆虫病原线虫成功地侵染寄主昆虫需要适宜的外界条件，如合适的温度、湿度和紫外辐射等。能否克服不良外界环境、成功在田间持续生存决定了昆虫病原线虫对害虫的防控效果。近年来随着抗干燥剂和抗辐射剂等保护性助剂的应用，昆虫病原线虫防治效果不断提高，应用范围不断扩大[7]。然而在农业生产实践中，土壤环境复杂，极端高温、低温或者干燥的条件都不利于昆虫病原线虫的实际应用。因此，对不良环境具备较强耐受能力的昆虫病原线虫品系具有更广泛应用的价值。

当前已报道的斯氏属昆虫病原线虫有100个种，异小杆属昆虫病原线虫有21个种[8]，它们对不良环境的抵御能力存在较大差异。吴霞等[9]对S.feltiae0619HT、S.bicornutum631PG、S.affine0619M、S.kraussei0657L、S.karii0663YC、H.megidis0627M、H.brevicaudis0641TY、H.marelatu0639G 八种昆虫病原线虫进行了测试，发现S.kraussei抗低湿胁迫能力最强，异小杆线虫抗低湿胁迫能力较斯氏线虫弱；低湿胁迫对昆虫病原线虫致病力无显著影响，且对S.felitiae和H.megidis的生殖力无显著影响。Patel 等[10]研究后发现小卷蛾斯氏线虫S.carpocapsae对快速干燥的耐性比S.feltiae、S.glasseri和S.riobrave更强。同一种类的昆虫病原线虫的不同地理种群之间，经过适应不同的生存环境，其抗逆能力也会发生较大变化。SteinernemafeltiaeIS-6 和IS-15品系（以色列）比S.feltiaeN8品系（德国）更耐干燥[11]。Somasekhar等[12]报道来自美国不同地理种群的S.carpocapsae线虫对高渗和缺氧胁迫的耐受能力差异显著。

为拓宽昆虫病原线虫防治害虫的范围和更有效地防治害虫，需要不断挖掘线虫资源，系统研究其生物学、生理生化等特性，为昆虫病原线虫的田间应用提供科学依据。本实验室多年来在我国不同地域采样，陆续分离到大量昆虫病原线虫种群。本文中对 17个不同种类的EPN品系进行了耐低温、高温和干燥等生物学测定，以期为生产提供优质的昆虫病原线虫种群，为不同种类的昆虫病原线虫的田间应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试线虫

SteinernemacarpocapsaeAll为本实验室保存，HeterorhabditismegidisXY-4和S.litoraleB13由新疆农业科学院微生物研究所馈赠。其他线虫品系均由本实验室在不同地区土壤中采集获得（表1）。不同种群的昆虫病原线虫均在 25 ℃用大蜡螟末龄幼虫活体培养，采用 White trap法收集侵染期幼虫（Infective juveniles，IJs），用灭菌水洗净后备用，试验用线虫保存时间不超过2周。

1.2 昆虫病原线虫耐热性测定

将1 mL线虫悬浮液（1000 IJs/mL）转移至24孔板孔中，封口膜封口后置于40 ℃恒温培养箱内，分别于1、2、3、4、6、18 h后从每孔中取出100 μL线虫液，加蒸馏水800 μL后，置于25 ℃恒温箱内。24 h后显微镜下检查线虫死亡数，物理刺激后不动的线虫判定为死亡。每个处理6个重复。以放置于25 ℃处理的线虫为对照。分别统计各处理线虫死亡率。

1.3 昆虫病原线虫耐低温能力测定

取1 mL线虫悬浮液（1000 IJs/mL）于24孔板中，用封口膜密封置于（-5±1）℃培养箱，分别于6、12、24、36、48、72 h后取出100 μL线虫悬浮液，加蒸馏水800 μL后置于25 ℃培养箱中，24 h后镜检线虫死亡数，判别线虫死活方法同上。以放置于25 ℃处理的线虫为对照，每个处理6个重复。

1.4 昆虫病原线虫耐干燥能力测定

取各品系侵染期线虫，分别滴加1 mL含有1000条线虫的甘油悬浮液（甘油浓度为25%）于24孔板中，封口后置于（25±1）℃培养箱中，分别于24、39、48、60、72 h后取出100 μL线虫悬浮液，加蒸馏水2 mL后置于25 ℃培养箱中，24 h后镜检线虫死亡数。以未添加甘油的线虫液作为对照，每处理6个重复[13,14]。

1.5 昆虫病原线虫对大蜡螟的致死率

取不同品系昆虫病原线虫悬浮液，调整线虫液浓度使其一致。24孔板中每孔放入2 g灭菌沙土，加入200 μL线虫悬浮液（含50条线虫），放入1头大蜡螟末龄幼虫，置于25 ℃培养箱中，24 h后检查死亡率。每个处理8头大蜡螟幼虫，重复3次。

1.6 数据统计与分析

百分数值经反正弦转换后运用SPSS 16.0进行方差分析，Tukey法检验不同处理之间的差异显著性，概率水平设P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 昆虫病原线虫耐高温测定

不同品系的昆虫病原线虫在25 ℃放置18 h后线虫个体死亡率均低于3%。将不同种类的线虫在40 ℃高温处理不同时间后取出置于25 ℃，线虫开始复苏并恢复运动能力。在40 ℃处理18 h后所有线虫几乎全部死亡。不同种群的昆虫病原线虫耐热能力不同，S.xinbinenseLFS48和S.sp ZLS3 耐热能力显著低于其他种群，经40 ℃处理1 h 后就有90%以上线虫个体死亡；S.hebeienseG6、S.feltiaeJY-90 和LFS67耐热力亦较低，40 ℃处理1 h后，虽然三个种群线虫个体死亡率低于6%，但是经40 ℃处理2 h后线虫几乎全部死亡。高温处理3 h后，所有参试的异小杆线虫品系的死亡率均在15%以下，而参试的斯氏线虫除S.tielingenseLFS65、S.ceratophorumHQA87 和S.carpocapsaeAll外，其余的几乎全部死亡。HeterorhabditisbacteriophoraHQ-4和H.beicherrianaNCWZ1经高温处理4 h后线虫个体死亡率低于10%，抗高温能力相对较强。SteinernematielingenseLFS65、S.ceratophorumHQA87 和S.carpocapsaeAll线虫对高温的抗性强，连续高温处理6 h后，线虫个体死亡率仍低于10%；而其他种类的昆虫病原线虫几乎全部死亡（表2）。

表2 不同品系昆虫病原线虫在高温下（40 ℃）的死亡率Table 2 Mortality of different entomopathogenic nematode strains exposed to 40 ℃ stress

2.2 昆虫病原线虫耐低温能力差异

不同品系的昆虫病原线虫在25 ℃放置72 h后线虫个体死亡率均低于5%。Steinenemasp.ZLS3、S.carpocapsaeAll对低温耐受性最好，-5 ℃处理72 h后线虫个体死亡率分别为1.14%和1.93%；其次是S.feltiaeLFS67、S.feltiaeJY90和H.beicherrianaNCWZ1，-5 ℃处理72 h后线虫个体死亡率低于40%。H.indicaHNPY2和S.litoraleB13线虫的低温耐受性差，-5 ℃处理24 h后线虫死亡率分别是100%和81.72%，均显著高于其他线虫种群。经过低温处理72 h后，H.beicherriana种内采集地不同的CD-11、LJ-24和NCWZ1三个品系线虫死亡率分别为100%、84.14%和23.65%，差异显著；S.feltiae种内4个品系线虫死亡率最低的为15.87%，最高的死亡率达到93%（表3）。

表3 不同品系昆虫病原线虫在低温（-5 ℃）下的死亡率Table 3 Mortality of different strains of entomopathogenic nematode exposed to -5 ℃ stress

2.3 昆虫病原线虫耐干燥能力差异

不同昆虫病原线虫种类与品系耐干燥能力测试结果参见表 4。所测试的各昆虫病原线虫在 25 ℃放置72 h后线虫个体死亡率均低于5%。经25%甘油水溶液处理72 h后，Steinernemasp ZLS3、S.ceratophorumHQA87、S.carpocapsaeAll和S.hebeienseG6线虫个体死亡率较低，分别为9.05%、7.25%、1.34%和15.86%，显著低于其他品系线虫的死亡率（P＜0.05）。所测试的异小杆线虫H.bacteriophora、H.beicherriana、H.indica和H.megidis耐干燥性都较差，干燥处理24 h后线虫死亡率均在85%以上。

表4 不同品系昆虫病原线虫经25%甘油水溶液处理后在干燥条件下的死亡率Table 4 Mortality of different strains of entomopathogenic nematodes exposure to 25% glycerol

2.4 昆虫病原线虫对大蜡螟致病力测定

通过上述试验筛选出9种在高温、低温或干燥的环境条件下有较强抗性的线虫品系，并测试其对大蜡螟末龄幼虫的致病力（图1）。在处理36 h后，S.ceratophorumHQA87、S.tielingenseLFS65、S.feltiaeJY-90和S.carpocapsaeAll对大蜡螟致死率达到100%。处理48 h后，H.beicherrianaLJ-24、S.feltiaeJY20-1对大蜡螟致死率也达到了 100%；对照大蜡螟无死亡。所测试的异小杆线虫H.bacteriophoraHQ-4、H.beicherrianaNCWZ1对大蜡螟致死时间比所测试的斯氏线虫稍长，24 h时大蜡螟无死亡，48 h时大蜡螟死亡率分别为73%和92%。

图1 不同品系昆虫病原线虫对大蜡螟末龄幼虫致死率Fig.1 Infectivity of infective juveniles from different EPN strains to last instars of G.mellonella

3 讨论

随着我国绿色农业发展，今后昆虫病原线虫在农业害虫防治中必将发挥重要的作用。当前昆虫病原线虫已成功地应用于很多农业害虫的防治[15,16]，但在实际生产中昆虫病原线虫的防治效果会受到线虫种类及品系、环境条件和施用技术等制约。不良的环境条件影响昆虫病原线虫的存活、侵入、致病和繁殖，发掘环境适应性强的线虫种群是拓展昆虫病原线虫在不同区域商业化应用的保障。

土壤温度是决定昆虫病原线虫防效的重要因素，较高或较低的温度对线虫的迁移、侵染寄主、繁殖和存活等都有不利的影响。已有报道不同种类EPN或不同来源的EPN品系对温度的抗性存在差异[17,18]。由甘肃省采集的H.megidis在25 ℃时对大蜡螟致死率最高，而S.feltiae在15 ℃、25 ℃和30 ℃下对大蜡螟致死率无显著差异[19]。Ali和Wharton[20]报道S.feltiae和H.bacteriophora对低温具有中等抗性，线虫经-13 ℃低温处理后对大蜡螟致病力未受影响。李星月等[21]发现线虫H.beicherrianaCherry品系在38 ℃放置44 h后线虫全部死亡，在40 ℃放置220 min后线虫全部死亡。在本试验中H.beicherrianaNCWZ1和H.beicherrianaLJ24在40 ℃放置4 h后死亡率仅为7.96%和0.69%。存在差异的原因可能是由于三者采集地不同。在本试验中，除了S.tielingenseLFS65、S.ceratophorumHQA87 和S.carpocapsaeAll外，所测试的异小杆线虫H.bacteriophora、H.beicherriana、H.indica、H.megidis耐热性均高于所测试的斯氏线虫（S.hebeiense、S.feltiae、S.litorale）；Heterorhabditisbacteriophora和S.feltiae同一种内不同品系间耐低温能力差异显著。SteinernematielingenseLFS65和S.xinbinenseLFS48 是本团队在辽宁省采集到的斯氏线虫新种类[22,23]；在其他地区尚未有这两种线虫的相关报道。本研究发现S.tielingenseLFS65具有很强的耐热性，不耐干燥；而S.xinbinenseLFS48耐干燥能力较强，但不耐高温。

昆虫病原线虫对水分具有很强的依赖性，干燥的环境条件限制了昆虫病原线虫在叶部和土壤害虫中的应用。湿度过大或者干燥都不利于昆虫病原线虫的侵染和长期存活，不同种类的EPN侵染昆虫的最适湿度不同[24]。Shapiro-Ilan等[25]报道S.carpocapsae抗干燥能力最强，其次是S.feltiae，异小杆线虫抗干燥能力较弱。邢玉芳等[26]报道经过低湿条件处理后甘肃省采集的斯氏属线虫S.feltiae、S.affine和S.kraussei等存活率高于H.megidis,H.brevicaudis和H.marelatu。甘油溶液可以使线虫进行渗透脱水[27]。在本试验中，利用甘油水溶液测试了不同EPN品系经过渗透压脱水后的存活状态。已商业化生产的S.carpocapsaeAll品系存活率最高，耐干燥能力强，与已有报道一致；Steinernemasp ZLS3及S.ceratophorumHQA87线虫的抗干燥能力高于其他测试线虫，与S.carpocapsaeAll无显著差异，可以作为干旱地区农业生产上线虫应用资源。

本文分别研究了温度和干燥条件对不同昆虫病原线虫存活的影响，测试了近几年在我国分离到的昆虫病原线虫新种类（S.tielingense、S.xinbinense、H.beicherriana、S.sp.ZLS3）的抗逆性等特征，根据不同条件筛选出了S.ceratophorumHQA87及S.tielingenseLFS65等优良线虫品系。在不同地域环境中有针对性地应用不同抗性的EPN品系可提高其杀虫效果，扩大其应用范围。本研究可对昆虫病原线虫更好地推广和应用提供支撑。