干细胞生长因子对动脉粥样硬化大鼠NO、ET-1、MMP-9的影响

王磊 方叶青 艾文 陈之杰 邱小燕 李华英 谢培益

(华中科技大学协和深圳医院心血管内科，深圳 南山 518000)

动脉粥样硬化(AS)是动脉壁多种细胞遭受各种因素影响出现的慢性炎症发展，是脑梗死和心脏动脉疾病的主要病因〔1〕。动脉血管壁内皮细胞与平滑肌细胞分化增加，诱导多种细胞因子导致血管通透性改变，大量的钙离子穿过血管内膜，增加血管内钙离子浓度，损伤部位形成堆积，诱导疾病产生〔2〕。大量研究发现，颈动脉和冠状动脉是极易出现斑块的部位，导致血液供应不足，如不及时治疗导致多种心脑血管疾病产生，威胁患者生命安全〔3〕。

国内外研究发现，AS的发生发展与机体炎症水平及多种血管因素水平密切相关。基质金属蛋白酶(MMP)-9对细胞的生物活性具有重要作用。对AS发生发展过程中具有重要作用〔4〕。内皮素(ET)-1由多个氨基酸组成的生物活性肽，是调节心血管功能的重要因子。一氧化氮(NO)在血管内皮细胞受到损伤时发挥保护作用〔5〕。干细胞生长因子(HGF)能够诱导血管多种细胞进行分化和增殖，并对受损的心脑血管相关细胞进行修复及再生作用，在动脉粥样硬化中发挥重要保护因子作用〔6〕。本研究旨在探讨HGF对AS大鼠NO、ET-1、MMP-9的影响。

1 材料与方法

1.1动物与分组 SPF级SD大鼠40只，由北京大学生命科学学院提供，10只为正常组，其余大鼠建立AS模型，分为三组，为AS组和HGF1组和HGF2组，AS组不进行HGF干预，HGF1组和HGF2组分别进行剂量为10 mg/(kg·d)和30 mg/(kg·d)的HGF干预，干预时间为12 w。

1.2AS模型建立 AS组和HGF1组和HGF2组在腹腔处注射700 000 U/kg的维生素D，注射3 d后，进行高级饲料喂养〔在给予基础饲料(81%)的方案上添加10%猪油、4%胆固醇、5%白糖〕，正常组喂养基础饲料，建模成功标准：主动脉出现斑块脱落，符合AS病理学特征视为造模完成。造模成功后，HGF1组和HGF2组进行灌胃10 mg/(kg·d)和30 mg/(kg·d)的HGF，其余组灌胃同体积的生理盐水，连续喂养12 w后，处死大鼠，苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠主动脉造模情况。

1.3HE染色检测各组胸主动脉病理 各组随机安乐死5只大鼠，提取胸主动脉组织，甲醛固定，酒精透水，PBS透明。石蜡包埋后，24 h后，采用HE染色，按照说明书进行，利用显微镜观察胸主动脉病理变化。

1.4各组血脂检测 各组抽取空腹静脉血2 ml，离心15 min，采用免疫比浊法检测总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平。

1.5各组血清中NO、ET-1的水平 将静脉血离心保留血清，采用全自动生化分析仪检测NO、ET-1的水平。

1.6细胞炎性因子检测 各组隔夜清晨无进食时，抽取静脉血，3～5 ml，离心，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清细胞因子白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。

1.7Western印迹检测胸主动脉组织MMP-9蛋白表达 在6孔板中加入100 μg的胰蛋白酶提取液，在注入2 ml的培养基停止消化，再将细胞提取液放入EP管中，并与胰蛋白酶提取液按照1∶100进行混合，再放入冰箱中冷冻10 min。使细胞完全裂变，成为E溶液；在EP管中放入各组胸主动脉组织并按照1∶100比例加入胰蛋白酶提取液2 ml，使细胞完全裂变，成为F溶液；再把E和F溶液以80∶1的体积进行摇匀，配制成工作液，放入37.5℃的保温箱中20 min，冷却后计算MMP-9蛋白的浓度。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行χ2、t检验。

2 结 果

2.1HGF对各组大鼠胸主动脉病理变化影响 正常组结构良好，平滑肌紧致排列，外膜较厚，无病变组织。AS组内皮细胞增厚，血管内皮出现病理改变，厚薄不均匀，呈现平滑肌纤维化趋势。HGF1组血管结构正常，出现内皮细胞脱落较AS组改善。HGF2组血管结构清除，内皮细胞结构好于AS组。见图1。

图1 各组大鼠胸主动脉病理变化(HE染色，×400)

2.2HGF对各组大鼠血清中血脂、NO、ET-1、水平的影响 AS组与正常组相比在血脂、NO、ET-1、水平均差异显著(P<0.05)，HGF1组与AS组TC、LDL-C、NO、ET-1指标上有明显差异(P<0.05)，HGF2组与HGF1组TG、TC、HDL-C及LDL-C、NO水平均差异显著(P<0.05)。见表1。

2.3HGF对各组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平的影响 与正常组相比，AS组IL-6、TNF-α水平均明显升高(P<0.05)，与AS组比较，HGF1组和HGF-2组IL-6水平均明显下降，且HGF2组明显低于HGF1组(P<0.05)，HGF2组TNF-α均明显低于HGF1、AS组(P<0.05)。见表1。

表1 HGF对各组大鼠血清中血脂、NO、ET-1、炎症因子水平的影响

2.4HGF各组胸主动脉组织中MMP-9蛋白水平的影响 AS组MMP-9蛋白水平(0.86±0.13)明显高于正常组(0.25±0.03，P<0.05)，与AS组相比，HGF1组、HGF2组水平MMP-9蛋白(0.71±0.09，0.43±0.06)明显低于AS组(P<0.05)，HGF2组明显低于HGF1组(P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠组织中MMP-9蛋白表达

3 讨 论

AS的形成较复杂，经过医学研究人员的不断探索，先后提出多种病理，如内皮质、血脂、炎症水平相关等〔7,8〕。但是目前研究认为该疾病的形成与多种原因共同导致有关，临床多采用口服抗凝药物治疗，但是该种药物血液浓度较低，长时间服用，耐药性增加〔9〕。

HGF具有强烈的促进血管生成作用，是神经系统首选药物〔10〕。研究表明，HGF能够促进心肌细胞的有丝分裂，对损伤血管有提高血液流速的作用，加快心脏供养能力的恢复，加快损伤器官的血液供应〔11〕。本研究说明HGF能够降低大鼠的血脂，具有缓解病情作用。血脂代谢功能失调与AS的发生、发展具有相关性〔12〕。动物实验表明，AS模型大鼠采用高级饲料喂养，发现血脂水平急剧升高，并在大鼠动脉观察有脂质颗粒沉积，说明两者之间呈现正相关〔13〕。模型大鼠血管内皮损伤加剧，肾素-血管紧张素-醛固醇系统(RAAS)水平升高，HGF能够修复受损的血管内皮细胞，降低RAAS水平，降低血脂水平。杨婷等〔14〕研究发现HGF能够改善冠状动脉粥样硬化大鼠血清的血脂水平，与减少单核细胞增加损伤血管内皮，缓解病情。这与杨清等〔15〕研究结果相似。

斑块中的巨噬细胞具有调节炎症介质的作用，多种细胞因子水平上升，而当血管内皮功能障碍时，血管收缩反应严重，ET-1水平升高时会导致血管内血小板大量增殖及聚集，有研究发现当对使用ET-1拮抗剂时NO表达上升，并抑制斑块形成〔16〕。说明ET-1和NO表达及作用具有负相关性。HGF通过对可以通过修复损伤血管内皮，增加血液微循环，并诱导多种效应蛋白表达，减少血管炎症反应，降低IL-6及TNF-α水平〔17〕。Luo等〔18〕研究发现HGF生物活性较广泛，有效改善血管壁变薄，并随着HGF浓度的升高，ET-1水平逐渐减少，NO水平升高发挥保护血管功能，改善病情。这与本文研究结果相似。大量研究证实，AS患者体内血清中MMP-9表达活跃，如不及时控制会导致斑块的损伤及破裂〔19〕。HGF能够通过抑制斑块形成，减少血管内皮损伤降低MMP-9水平，这与赵晟昊等〔20〕研究结果相似。