芦荟苷通过调控PI3K/AKT信号通路抑制膀胱癌细胞T24增殖、促进细胞凋亡

陈瑞廷 赵俊峰 董建设 孙继建 张林超 王国桥 杨锦建 贾占奎

(1河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院) 泌尿外科，河南 郑州 450002；2郑州大学第一附属医院泌尿外科)

膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，具有高复发率和高死亡率的特点〔1〕；中药因其取材广，毒副作用小等优点可用于膀胱癌的治疗〔2〕。芦荟苷是从芦荟的主要活性成分之一，研究显示芦荟苷具有抗癌作用，芦荟苷可抑制食管癌细胞系KESY70的增殖和侵袭，促进细胞凋亡〔3〕。芦荟苷可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，同时可以抑制体外成瘤能力〔4〕。芦荟苷可抑制胃癌细胞的增殖和迁移〔5〕。芦荟苷可通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径抑制肝细胞癌的生长和侵袭并诱导其凋亡和自噬，从而增强抗肿瘤作用〔6〕。但芦荟苷对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及机制尚不清楚。研究报道黄芩素通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制膀胱癌细胞增殖，诱导细胞周期阻滞及凋亡〔7〕。虫草素通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导人膀胱癌T24细胞凋亡〔8〕。本实验旨在研究芦荟苷对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及机制是否与PI3K/AKT信号通路有关。

1 材料与方法

1.1材料 膀胱癌细胞T24购自美国ATCC；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；芦荟苷(纯度≥98%)、顺铂(纯度≥98.5%)购自上海恒斐生物科技有限公司；PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002购自上海源叶生物科技有限公司；AKT激活剂胰岛素样生长因子(IGF)-Ⅰ购自北京博奥森生物技术有限公司；细胞计数试剂盒(CCK)-8、凋亡检测试剂盒、放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液购自北京百奥莱博科技有限公司；一抗及山羊抗兔IgG-HRP购自上海恒斐生物科技有限公司。

1.2细胞处理与分组 膀胱癌细胞T24用RPMI1640培养液常规培养，分别用12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L芦荟苷处理T24细胞，作为不同浓度芦荟苷组，其中用200 μmol/L芦荟苷处理的T24细胞，记为芦荟苷组，10 μmol/L顺铂处理的T24细胞记为顺铂组，不做任何处理的T24细胞作为空白组。

用50 μmol/L LY294002和200 μmol/L芦荟苷处理T24细胞，记为芦荟苷+AKT抑制剂组；用100 ng/ml IGF-Ⅰ和200 μmol/L芦荟苷处理T24细胞，记为芦荟苷+AKT激活剂组；用等量的磷酸盐缓冲液(PBS)和200 μmol/L芦荟苷处理T24细胞为对照，记为芦荟苷+PBS组。

1.3CCK-8检测细胞增殖存活率 各组细胞培养24、48、72 h时，按试剂盒说明操作，每孔加入10 μl CCK-8试剂，最后用酶标仪检测490 nm波长处吸光度值(A)。计算细胞增殖存活率(%)。

1.4流式细胞仪检测细胞周期 收集各组细胞，用预冷的70%乙醇固定，加入核糖核酸酶(RNase)A，37℃水浴30 min，加入400 μl碘化丙啶(PI)后4℃避光30 min，上机流式细胞仪检测，同时用DNA细胞周期分析软件进行检测分析。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，漂洗，分别加入膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和PI，混匀后避光孵育10 min；上流式细胞仪检测。

1.6Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、B细胞淋巴瘤(Bcl)-xL、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved caspase)-3、Cleaved caspase-9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达 提取各组细胞的总蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏氟乙烯膜上，封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜；加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，显影、成像，分析蛋白条带灰度值。

1.7统计学分析 采用SPSS20.0软件进行方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1不同浓度的芦荟苷对膀胱癌细胞存活的影响 与空白组相比，不同浓度芦荟苷处理膀胱癌细胞48 h及72 h后细胞增殖存活率显著降低(P<0.05)，浓度25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的芦荟苷在处理膀胱癌细胞24 h时细胞增殖存活率也显著降低(P<0.05)；顺铂组24 h、48 h及72 h细胞增殖存活率显著降低(P<0.05)，见表1。后续试验选用200 μmol/L芦荟苷。

表1 不同浓度芦荟苷对膀胱癌细胞增殖存活率的影响

2.2芦荟苷及AKT抑制剂、AKT激活剂对膀胱癌细胞存活的影响 与空白组相比，芦荟苷组和顺铂组24、48、72 h细胞增殖存活率显著降低(P<0.05)；与芦荟苷+PBS组相比，芦荟苷+AKT抑制剂组24、48、72 h细胞增殖存活率显著降低(P<0.05)，芦荟苷+AKT激活剂组24、48、72 h细胞增殖存活率显著升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组对膀胱癌细胞增殖、细胞周期、蛋白表达的影响

2.3芦荟苷及AKT抑制剂、AKT激活剂对膀胱癌细胞周期的影响 与空白组相比，芦荟苷组和顺铂组G0-G1期细胞所占比例显著升高，S期细胞所占比例显著降低(均P<0.05)；与芦荟苷+PBS组相比，芦荟苷+AKT抑制剂组G0-G1期细胞所占比例显著升高，S期细胞所占比例显著降低，芦荟苷+AKT激活剂组G0-G1期细胞所占比例显著降低，S期细胞所占比例显著升高(均P<0.05)，见表2。

2.4芦荟苷及AKT抑制剂、AKT激活剂对膀胱癌细胞周期蛋白表达的影响 与空白组相比，芦荟苷组和顺铂组CyclinD1蛋白表达水平显著降低，P21蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与芦荟苷+PBS组相比，芦荟苷+AKT抑制剂组CyclinD1蛋白表达水平显著降低，P21蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，芦荟苷+AKT激活剂组CyclinD1蛋白表达水平显著升高，P21蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，见表2、图1。

2.5芦荟苷及AKT抑制剂、AKT激活剂对膀胱癌细胞凋亡的影响 与空白组相比，芦荟苷组和顺铂组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与芦荟苷+PBS组相比，芦荟苷+AKT抑制剂组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，芦荟苷+AKT激活剂组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，见图2，表3。

1～6:空白组，芦荟苷组，芦荟苷+PBS组，芦荟苷+AKT抑制剂组，芦荟苷+AKT激活剂组，顺铂组，图3同图1 Western印迹检测膀胱癌细胞周期蛋白CyclinD1和 p21蛋白表达

图2 流式细胞术检测膀胱癌细胞凋亡

2.6芦荟苷及AKT抑制剂、AKT激活剂对膀胱癌细胞凋亡蛋白表达的影响 与空白组相比，芦荟苷组和顺铂组Bcl-xL蛋白表达水平显著降低，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与芦荟苷+PBS组相比，芦荟苷+AKT抑制剂组Bcl-xL蛋白表达水平显著降低，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，芦荟苷+AKT激活剂组Bcl-xL蛋白表达水平显著升高，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，见表3，图3。

2.7芦荟苷及AKT抑制剂、AKT激活剂对膀胱癌细胞PI3K/AKT信号通路蛋白表达的影响 与空白组相比，芦荟苷组和顺铂组p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与芦荟苷+PBS组相比，芦荟苷+AKT抑制剂组p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，芦荟苷+AKT激活剂组p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；而各组PI3K、AKT蛋白水平无显著差异(P>0.05)，见表3。

表3 各组对膀胱癌细胞凋亡蛋白表达、PI3K/AKT信号通路、细胞凋亡的影响

图3 Western印迹检测膀胱癌细胞凋亡蛋白Bcl-xL、 Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表达

3 讨 论

细胞增殖和凋亡失衡可导致肿瘤的发生，近年来研究表明中药及其天然药物活性成分具有抗肿瘤作用〔9,10〕。寻找高效低毒的抗肿瘤药物一直是肿瘤治疗的研究热点。研究报道芦荟苷通过靶向高迁移率族框(HMGB)1抑制AKT-mTOR-P70S6K和细胞外信号调节激酶(ERK)-cAMP调节元件结合(CREB)信号通路激活可诱导胃癌细胞凋亡〔11〕。芦荟苷通过激活p38和c-Jun NH2-末端激酶(JNK)信号通路并抑制ERK信号通路在体外诱导人胃癌细胞凋亡〔12〕。芦荟苷可能通过ROS-促分裂原激活的蛋白激酶(MEK)信号传导途径和p53磷酸化诱导肺癌A549细胞凋亡〔13〕。Bcl-xL是抗凋亡蛋白，下调其表达可促进细胞凋亡〔14〕。本实验结果说明芦荟苷可抑制膀胱癌细胞增殖，诱导细胞周期停滞和凋亡。

恶性肿瘤的发生发展是多种信号传导通路共同作用的结果，PI3K/AKT信号通路的异常活化参与多种肿瘤细胞存活、增殖、侵袭的等发生发展过程〔15〕。隐丹参酮通过抑制PTEN/PI3K/AKT途径抑制膀胱癌细胞增殖并促进细胞凋亡〔16〕。冬凌草甲素可通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制前列腺癌细胞增殖，诱导G2/M细胞周期停滞和凋亡〔17〕。蝙蝠葛碱通过抑制肾癌细胞中的PI3K/AKT信号传导途径抑制细胞活力并诱导细胞周期停滞和凋亡〔18〕。本实验结果表明芦荟苷可能抑制PI3K/AKT信号通路。PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002可增强芦荟苷对膀胱癌细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。而PI3K/AKT信号通路IGF-Ⅰ逆转了芦荟苷对膀胱癌细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。

综上，芦荟苷可能通过抑制PI3K/AKT信号通路抑制膀胱癌细胞T24增殖、促进细胞凋亡。