高危型人乳头瘤病毒单一类型感染和多重感染对宫颈癌中细胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表达量的影响

张峻霄　胡春燕　闫坤　贾亮　刘晨　楚光华　高巧莲　刘朝阳

[摘要] 目的 研究高危型人乳頭瘤病毒（hr-HPV）单一类型感染和多重感染对宫颈癌中细胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表达量的影响。 方法 选择2010年1月～2016年1月在西北妇女儿童医院接受手术切除治疗的宫颈癌患者118例，收集宫颈癌组织，测定HPV的类型并分为hr-HPV阳性和hr-HPV阴性、hr-HPV多重感染和hr-HPV单一感染。检测宫颈癌组织中细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的表达量。 结果 hr-HPV阳性92例、hr-HPV阴性26例，hr-HPV多重感染37例、hr-HPV单一感染55例。hr-HPV阳性宫颈癌组织中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的蛋白含量显著高于hr-HPV阴性宫颈癌组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。hr-HPV多重感染宫颈癌组织中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的蛋白含量显著高于hr-HPV单一感染宫颈癌组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 hr-HPV多重感染能够通过增加宫颈癌组织中细胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表达量的方式来加速细胞周期进程、抑制细胞凋亡，进而促进癌细胞的增殖。

[关键词] 宫颈癌；人乳头瘤病毒；细胞周期；增殖；凋亡

[中图分类号] R737.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（c）-0099-04

Effect of single type and multiple infection of high risk HPV on the expression of cell cycle protein and anti-apoptotic protein in cervical cancer

ZHANG Junxiao1 HU Chunyan1 YAN Kun1 JIA Liang1 LIU Chen1 CHU Guanghua1 GAO Qiaolian2 LIU Zhaoyang2

1.Second Department of Gynaecology， Northwest Women and Children's Hospital， Shaanxi Province， Xi'an 710061， China； 2.Outpatient Service of Department of Gynaecology， Northwest Women and Children's Hospital， Shaanxi Province， Xi′an 710061， China

[Abstract] Objective To study the effect of single type and multiple infection of high risk human papillomavirus （hr-HPV） on the expression of cell cycle protein and anti-apoptotic protein in cervical cancer. Methods 118 cervical cancer patients received surgical resection in Northwest Women and Children's Hospital during January 2010 to January 2016 were enrolled and cervical cancer tissues were collected. HPV types were determined and divided into hr-HPV positive and hr-HPV negative， hr-HPV multiple infection and hr-HPV single infection. The expressions of CyclinB1， CyclinD1， CDK1， CDK6 and anti apoptotic protein Bcl-2， Bcl-xl and Survivin in cervical cancer tissues were detected. Results Hr-HPV positive was 92 cases， hr-HPV negative was 26 cases， hr-HPV multiple infection was 37 cases， hr-HPV single infection was 55 cases. The protein contents of CyclinB1， CyclinD1， CDK1， CDK6， Bcl-2， Bcl-xl and Survivin in hr-HPV positive cervical carcinoma tissues were significantly higher than those in hr-HPV negative cervical carcinoma tissues， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The protein contents of CyclinB1， CyclinD1， CDK1， CDK6， Bcl-2， Bcl-xl and Survivin in multiple hr-HPV infection cervical cancer tissues were significantly higher than those in single infection cervical carcinoma， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Multiple infection of hr-HPV can accelerate the progression of cell cycle and inhibit apoptosis of cell through upregulating the expression of cell cycle proteins and anti-apoptosis protein in cervical carcinoma， thereby promoting cancer cell proliferation.

[Key words] Cervical cancer； Human papilloma virus； Cell cycle； Proliferation； Apoptosis

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，人乳头状瘤病毒（HPV）感染是造成宫颈癌及癌前病变最重要的危险因素。目前已知的HPV 160余种，其中近30种HPV能够感染肛门及生殖器上皮，且14种属于高危致癌类型[1-2]。高危型HPV（hr-HPV）感染宫颈上皮细胞会造成细胞内多种细胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表达异常，进而促进细胞增殖并增加癌变风险[3-4]。相关流行病学资料显示，hr-HPV多重感染患者发生宫颈癌的风险远远超过hr-HPV单一类型感染[5-6]。但是，关于hr-HPV多重感染对宫颈癌病情发生、发展过程中细胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表达的影响未见明确报道。本研究主要分析hr-HPV单一类型感染和多重感染对宫颈癌中细胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表达量的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010年1月～2016年1月在西北妇女儿童医院接受手术切除治疗的宫颈癌患者118例作为研究对象，平均年龄（39.6±5.5）岁，术后收集宫颈癌组织并保存于-80℃冰箱。宫颈癌组织中，hr-HPV阳性92例、hr-HPV阴性26例，hr-HPV多重感染37例、hr-HPV单一感染55例。hr-HPV阳性患者平均年龄（47.5±5.2）岁，中高分化58例、低未分化34例；hr-HPV阴性患者平均年龄（48.2±4.9）岁，中高分化15例、低未分化11例。hr-HPV多重感染患者平均年龄（47.9±5.5）岁，中高分化23例、低未分化14例；hr-HPV单一感染患者平均年龄（47.1±4.9）岁，中高分化35例、低未分化23例。hr-HPV阳性与阴性患者、hr-HPV多重感染与hr-HPV单一感染患者的年龄、分化程度比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

納入标准：①无HPV感染治疗病史；②手术切除后经病理检查明确宫颈癌的诊断；③通过医院伦理委员会，纳入研究患者具有知情权，并在入组前签署知情同意书。排除标准：①合并远处转移的患者；②未取得知情同意的患者；③近1个月内行妇科相关检查及治疗。

1.2 试剂与仪器

HPV检测试剂盒及DNA提取液购自中山大学达安基因股份有限公司，宫颈管刷、宫颈脱落细胞取样器购自天津伊诺新康医疗器械科技有限公司，引物、探针合成由上海生物工程技术有限公司提供，Perfect Real Time试剂购自北京智杰方远科技有限公司。酶联免疫吸附试剂盒以及BCA蛋白定量试剂盒购于南京建成生物公司。

1.3 HPV分型检测

取宫颈癌组织，采用PCR-RDB法进行HPV分型检测，经生物素标记的引物进行靶核酸的扩增，第一步通过茎环引物来合成互补DNA，再通过RNA的逆转录系统对10 ng RNA进行逆转录体系进行反应，在PCR管加入10 μL的逆转录缓冲液，总的RNA浓度调整到2 ng/μL，最后加入5 μL的逆转录引物，在冰上混匀之后反应5 min，接着进行梯度变性反应，温度时间递减；第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反应体系，反应体系为2×的 PCR Taqman Universal的混合液以及Taqman RNA的特异性引物，通过逆转录体系进行反应，cDNA共5 μL加入到RNA去酶的水中，将体积扩增至20 μL，通过循环反应94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min递减的扩张40个循环之后，以积分吸光度差值来确定hr-HPV和低危型HPV。

1.4 蛋白表达量检测方法

取宫颈癌组织，加入蛋白裂解液RIPA后充分匀浆，将匀浆液放置在4℃离心机中以12000×g的离心力离心20 min，离心后弃去沉淀、保留上清，而后采用酶联免疫吸附试剂盒测定上清液中细胞周期蛋白（Cyclin）B1、CyclinD1、细胞周期蛋白相关激酶（CDK）1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的含量，采用BCA试剂盒测定上清液中总蛋白的含量，计算每毫克总蛋白样本中所含目的蛋白的含量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hr-HPV感染对宫颈癌组织中细胞周期蛋白表达的影响

hr-HPV阳性宫颈癌组织中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6蛋白含量显著高于hr-HPV阴性宫颈癌组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 hr-HPV感染对宫颈癌组织中抗凋亡蛋白表达的影响

hr-HPV阳性宫颈癌组织中Bcl-2、Bcl-xl、Survivin蛋白含量显著高于hr-HPV阴性宫颈癌组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 hr-HPV单一和多重感染对宫颈癌组织中细胞周期蛋白表达的影响

hr-HPV多重感染宫颈癌组织中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6蛋白含量显著高于hr-HPV单一感染宫颈癌组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.4 hr-HPV单一和多重感染对宫颈癌组织中抗凋亡蛋白表达的影响

hr-HPV多重感染宫颈癌组织中Bcl-2、Bcl-xl、Survivin蛋白含量显著高于hr-HPV单一感染宫颈癌组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

HPV易感于黏膜鳞状上皮及表皮组织，自从1976年发现HPV可能通过性传播致癌以来，宫颈癌与HPV之间的相关性研究成为了肿瘤病毒学的热门课题。低危型HPV通常存在于宫颈良性或低度病变的病灶，而hr-HPV可诱发全身多部位癌变[7-8]。宫颈癌组织中hr-HPV的感染率显著高于宫颈良性病变组织[9-11]。在感染HPV初期，宫颈上皮组织未出现增生或异常增生等形态学的改变[8]；病毒的DNA整合进入宿主细胞的基因组可引起多种基因表达，鳞状上皮细胞逐步出现核增大、核异性、空泡变等改变，进而增加组织异常增生、癌变等的发生风险[12-14]。

宫颈组织中hr-HPV的持续感染会将病毒的遗传物质整合进入宿主细胞的基因组，进而造成宿主细胞中多种基因表达的改变[15-16]。我们通过分析hr-HPV感染对宫颈癌组织中细胞周期蛋白以及抗凋亡蛋白表达量的影响发现，hr-HPV阳性宫颈癌组织中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的蛋白含量显著高于hr-HPV阴性宫颈癌组织。这就说明hr-HPV感染能够通过增加细胞周期蛋白以及抗凋亡蛋白表达的方式来诱导宫颈癌组织中的细胞增殖，进而促进病情的发展。

CyclinB1、CyclinD1分别能够与CDK1、CDK6形成复合体并缩短细胞周期G2/M期的转换时间、加速细胞周期进程[17-18]；Bcl-2和Bcl-xl能够调节线粒体膜上转换孔的开放和闭合状态，减少细胞色素C的释放，进而抑制下游caspase级联凋亡通路的激活[19]；Survivin能够直接抑制多种caspase分子的激活并拮抗细胞凋亡过程[20]。我们通过分析hr-HPV多重感染和单一类型感染对上述细胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表达量的影响可知，hr-HPV多重感染宫颈癌组织中CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6、Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的蛋白含量显著高于hr-HPV单一感染宫颈癌组织。这就说明hr-HPV多重感染能够增加宫颈癌组织中细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1、CDK1、CDK6以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Survivin的表达量，进而加速细胞周期进程、抑制细胞凋亡。

综上所述，hr-HPV多重感染能够通过增加宫颈癌组织中细胞周期蛋白、抗凋亡蛋白表达量的方式来加速细胞周期进程、抑制细胞凋亡，进而促进癌细胞的增殖。

[参考文献]

[1] Wongsena M，Suebsamran P，Panomket P，et al. Prognostic factors of human papillomavirus genotypes of invasive cervical carcinoma：an analytical cross-sectional study in lower north-east Thailand [J]. J Med Assoc Thai，2014，97（4）：12-19.

[2] 陳锐，赵健，朱丽荣，等.人类乳头状瘤病毒分型检测在宫颈癌筛查中的临床研究[J].中华实验和临床病毒学杂志，2014，28（6）：429-432.

[3] Zouheir Y，Fechtali T，Elgnaoui N. Human papillomavirus genotyping and p16（INK4a） expression in cervical lesions：a combined test to avoid cervical cancer progression [J]. J Cancer Prev，2016，21（2）：121-125.

[4] Zhong P，Li J，Gu Y，et al. P16 and Ki-67 expression improves the diagnostic accuracy of cervical lesions but not predict persistent high risk human papillomavirus infection with CIN1 [J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（3）：2979-2986.

[5] 张淼，周秀春，张冠群.人乳头瘤病毒检测及TCT检查在宫颈癌筛查中的临床价值研究[J].现代预防医学，2016， 43（5）：836-838，918.

[6] Khan MJ，Castle PE，Lorincz AT，et al. The elevated 10-year risk of cervical precancer and cancer in women with Human Papillomavirus（HPV）type 16 or 18 and the possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice [J]. J Natl Cancer Inst，2015，97（14）：1072-1079.

[7] Castellsagué X，Pawlita M，Roura E，et al. Prospective seroepidemiologic study on the role of Human Papillomavirus and other infections in cervical carcinogenesis：evidence from the EPIC cohort [J]. Int J Cancer，2014，135（2）：440-452.

[8] Johnson DC，Bhatta MP，Smith JS，et al. Assessment of high-risk Human Papillomavirus infections using clinician-and self-collected cervical sampling methods in rural women from far western Nepal [J]. PLoS One，2014，9（6）：e101255.

[9] 付敏，杨彪，杨宗桥.人乳头状瘤病毒感染与宫颈病变临床价值的研究[J].中国妇幼保健，2014，29（18）：2875-2877.

[10] 苏卿，潘卓，胡嫦娥，等.TCT、HPV和阴道镜下宫颈组织活检对宫颈病变的诊断价值[J].中国当代医药，2016， 23（11）：84-87.

[11] Castle PE，Hunt WC，Langsfeld E，et al. Three-year risk of cervical precancer and cancer after the detection of low-risk Human Papillomavirus genotypes targeted by a commercial test [J]. Obstet Gynecol，2014，123（1）：49-56.

[12] Khan MJ，Castle PE，Lorincz AT，et al. The elevated 10-year risk of cervical precancer and cancer in women with Human Papillomavirus（HPV）type 16 or 18 and the possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice [J]. J Natl Cancer Inst，2015，97（14）：1072-1079.

[13] 李玉霞，张燕.高危型HPV筛查联合液基细胞学检测在宫颈癌筛检中的应用价值[J].海南医学院学报，2014， 20（2）：223-225.

[14] Mure？鬤an D，Rotar IC，Apostol S，et al. HPV immunohistochemical testing and cervical dysplasia [J]. Clujul Med，2016，89（2）：236-240.

[15] Valen？觭a JE，Gon？觭alves AK，Guerreiro da Silva ID，et al. High risk HPV E6/E7 oncoprotein expression in women with high grade squamous intraepithelial lesion [J]. Rev Bras Ginecol Obstet，2016，38（3）：154-159.

[16] 白彩云，王延明.宫颈上皮内瘤变患者高危型HPV感染与潜在恶性生物学行为的关系[J].海南医学院学报，2015，21（9）：1290-1293.

[17] Umbreit C，Erben P，Faber A，et al. MMP9，cyclin D1 and β-catenin are useful markers of p16-positive squamous cell carcinoma in therapeutic EGFR inhibition in vitro [J]. Anticancer Res，2015，35（7）：3801-3810.

[18] Wang N，Wei H，Yin D，et al. MicroRNA-195 inhibits proliferation of cervical cancer cells by targeting cyclin D1a [J]. Tumour Biol，2016，37（4）：4711-4720.

[19] Zhou XL，Wang M. Expression levels of survivin，Bcl-2，and KAI1 proteins in cervical cancer and their correlation with metastasis [J]. Genet Mol Res，2015，14（4）：17059-17067.

[20] Gao M，Li Y，Ji X，et al. Disturbance of Bcl-2，Bax，Caspase-3，Ki-67 and C-myc expression in acute and subchronic exposure to benzo（a）pyrene in cervix [J]. Acta Histochem，2016，118（2）：63-73.

（收稿日期：2016-08-16 本文編辑：李亚聪）