金银花提取物通过激活Nrf2通路对急性肝损伤模型大鼠肝功能的保护作用

鲁荣华 杨群 赵玲

(滕州市中心人民医院 1感染病科，山东 滕州 277599；2功能检查科)

核转录因子E2相关因子(Nrf)2通路是体内重要抗氧化应激通路，其在肝损伤、肺损伤等机体多种脏器损伤中发挥重要作用，目前已成为肝脏疾病重要潜在治疗靶点〔1～4〕。金银花具有清热解毒、解暑化湿等作用，其有效成分中黄铜、绿原酸等是天然抗氧化剂，可清除体内超氧离子自由基，保护机体免受氧化损伤〔5，6〕。金银花提取物(HFE)可改善肝脏病理损伤，降低血糖，改善小鼠胰岛素抵抗〔7〕，但是否通过Nrf2抗氧化损伤通路发挥作用尚未可知。本研究采用四氯化碳(CCl4)诱导并建立急性肝损伤大鼠模型，以探究HFE对急性肝损伤大鼠的保护作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验大鼠 50只6周龄清洁级SD大鼠，雄性，体重200～220 g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(苏)2016-0010，使用许可证号：SYXK(苏)2017-0015。于20～25℃温度，50%～70%湿度、12 h/12 h光照、黑暗条件下，自由采食，自由饮水。本研究经过医院动物伦理学委员会批准通过。

1.2主要试剂及仪器 HFE(绿原酸含量6%)购自新乡博凯生物技术有限公司；CCl4(货号：48604)购自Sigma-Aldrich公司；大鼠丙二醛(MDA)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号：ER1878)购自武汉菲恩生物科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒(货号：YM-2972B)购自上海远慕生物科技有限公司；大鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)ELISA试剂盒(货号：ZK-R4121)购自深圳子科生物科技有限公司；大鼠谷丙转氨酶(ALT)ELISA试剂盒(货号：ab234579)、谷草转氨酶(AST)ELISA试剂盒(货号：ab263883)、碱性磷酸酶(ALP)ELISA试剂盒(ab83259)、兔源一抗anti-Nrf2(货号：ab137550)、anti-血红素氧化酶(HO)-1(货号：ab13243)、anti-β-actin(货号：ab179467)，二抗羊抗兔IgG(货号：ab205718)均购自英国Abcam公司；引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ix73显微镜购自日本Olympus公司；MODEL550型酶标仪购自美国Bio-Rad公司等。

1.3方法

1.3.1模型制备及分组 50只SD大鼠随机分为5组：对照组(NC组)、模型组(M组)、M+HFE组、M+Nrf2通路抑制剂ML385组(M+ML385组)、M+ ML385+HFE组，每组10只。M+HFE组给予HFE 62.5 mg/kg，约为人的临床等效用量；M+ML385组给予ML385 30 mg/kg；M+ML385+HFE组给予ML385 30 mg/kg及HFE 62.5 mg/kg；NC组、M组灌胃等量蒸馏水，灌胃量均为5 ml/kg，连续干预4 w，各组灌胃最后1 d禁食16 h，除NC组外其余4组一次性腹腔注射0.12% CCl4花生油(1 ml/kg)诱导急性肝损伤模型〔8〕，NC组腹腔注射等量花生油，4 h后每组大鼠进行最后1次灌胃，之后禁食不禁水，24 h后腹主动脉采血，处死后取肝脏组织，部分置于液氮中保存备用，部分进行石蜡包埋保存备用。

1.3.2生化指标检测 血液常规离心后收集血清，采用ELISA检测各组大鼠血清肝功能指标ALT、AST、ALP水平；制备大鼠肝脏组织匀浆液，采用ELISA检测各组大鼠肝脏组织氧化应激指标MDA、SOD、GSH-Px水平，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3肝脏组织病理学检测 取各组大鼠部分肝脏组织石蜡包埋块，以5 μm厚度进行切片，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肝脏组织病理学形态变化。

1.3.4实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 采用Trizol提取肝脏组织总RNA，浓度及纯度检验合格后制备cDNA，采用RT-qPCR法扩增Nrf2、HO-1 mRNA部分片段。Nrf2上游引物序列：5′-GGGCAAGCGACTCATGGTCAT-3′，下游引物序列：5′-AAGCTGCAT ACAGTCTTCAAA-3′；HO-1上游引物序列：5′-GATAGAGCGCAACAAGCAGAA-3′，下游引物序列：5′-CAGTGAGGCCCATACCAGAAG-3′；内参β-actin上游引物序列：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCA-3′，下游引物序列：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。反应体系(20 μl)：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0 μl，ROX Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/μl)2.0 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，双蒸水(ddH2O) 6.0 μl。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法定量分析肝脏组织Nrf2、HO-1 mRNA相对表达水平。

1.3.5Western印迹 提取各组大鼠肝脏组织总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，置于-80℃保存备用。取50 mg蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜转膜，室温封闭，添加anti-Nrf2(1∶1 000)、anti-HO-1抗体(1∶2 000)、anti-β-actin抗体(1∶5 000)，4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，添加二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)室温孵育2 h，显色，曝片，观察结果并分析蛋白灰度值。

1.4统计学分析 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组血清肝功能指标比较 与NC组比较，M组血清ALT、AST、ALP水平显著增加(P<0.05)；与M组比较，M+HFE组血清ALT、AST、ALP水平显著降低(P<0.05)，M+ML385组血清ALT、AST、ALP水平显著增加(P<0.05)；M+HFE+ML385组血清ALT、AST、ALP水平显著高于M+HFE组，显著低于M+ML385组(P<0.05)，见表1。

表1 各组血清肝功能指标及肝脏组织氧化应激指标比较

2.2各组肝脏组织病理学形态变化 NC组肝脏小叶结构清晰，未见异常形态变化；M组肝脏组织多处融合坏死，肝细胞肿胀、变性，有大量炎性细胞浸润；M+HFE组、M+HFE+ML385小叶结构尚存在，坏死灶减少；M+ML385组肝脏组织存在大量坏死灶，肝细胞变性、肿胀程度增加，见图1。

图1 各组肝脏组织病理学形态变化(HE染色，×200)

2.3各组肝脏组织氧化应激指标水平比较 与NC组比较，M组肝脏组织MDA含量显著增加，SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)；与M组比较，M+HFE组肝脏组织MDA含量显著降低，SOD、GSH-Px活性显著增加(P<0.05)，M+ML385组肝脏组织MDA含量显著增加，SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)；M+HFE+ML385组肝脏组织MDA含量显著高于M+HFE组，显著低于M+ML385组(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性显著低于M+HFE组，显著高于M+ML385组(P<0.05)，见表1。

2.4各组肝脏组织Nrf2、HO-1 mRNA相对表达水平比较 与NC组比较，M组肝脏组织Nrf2、HO-1 mRNA表达水平显著增加(P<0.05)；与M组比较，M+HFE组肝脏组织Nrf2、HO-1 mRNA表达水平显著增加(P<0.05)，M+ML385组肝脏组织Nrf2、HO-1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；M+HFE+ML385组肝脏组织Nrf2、HO-1 mRNA表达水平显著低于M+HFE组，显著高于M+ML385组(P<0.05)，见表2。

表2 各组肝脏组织Nrf2、HO-1 mRNA相对表达 水平比较

2.5各组肝脏组织Nrf2、HO-1蛋白表达水平比较 与NC组比较，M组肝脏组织Nrf2、HO-1蛋白表达量显著增加(P<0.05)；与M组比较，M+HFE组肝脏组织Nrf2、HO-1蛋白表达量显著增加(P<0.05)，M+ML385组肝脏组织Nrf2、HO-1蛋白表达量显著降低(P<0.05)；M+HFE+ML385组肝脏组织Nrf2、HO-1蛋白表达量显著低于M+HFE组，显著高于M+ML385组(P<0.05)，见图2、表3。

1～5：NC组、M组、M+HFE组、M+ML385组、M+HFE+ML38组图2 Western印迹检测各组肝脏组织Nrf2、HO-1蛋白表达

表3 各组肝脏组织Nrf2、HO-1蛋白 表达量比较

3 讨 论

CCl4是一种无色有毒液体，主要通过刺激机体自由基过量形成，引起细胞坏死引发链式过氧化反应，可造成化学性器官损伤，其中以肝损伤最快速且最显著，广泛用于动物实验中急慢性肝损伤动物模型的建立，简单、易行、可靠且可重复性好〔9，10〕。本研究结果显示，CCl4作用后产生大量氧自由基，抑制抗氧化酶产生，诱导脂质过氧化，提示CCl4诱导急性肝损伤模型大鼠制备成功。肝脏是机体最大的消化腺，是体内物质能量代谢中心，目前，临床研究显示，药物引起的肝损伤危害性极大，因此对保肝药物的筛选及作用机制探究具有重要意义。

金银花又名忍冬、二花、银花等，首次记载于《本草纲目》中，是一味传统中药，富含多种化学成分，其中绿原酸、异绿原酸等有机酸类化合物，金丝桃苷、木犀草素等黄酮类化合物均具有广泛抗菌、消炎、抗病毒、抗氧化、免疫调节、护肝降糖等多种药理作用〔11，12〕。有研究报道，HFE对乙醇导致小鼠化学性肝损伤有一定保护作用〔13〕，可能与通过增加血清抗氧化酶GSH-Px、SOD活性，降低MDA含量，提高机体抗氧化能力，保护机体细胞免受氧化应激损伤有关〔14〕。许万紫等〔15〕报道，HFE可通过清除氧自由基，减轻氧化应激，保护小鼠心肌缺血再灌注损伤。本研究结果提示HFE可减轻CCl4诱导的大鼠急性肝损伤，可能与提高其抗氧化能力有关。

Nrf2通路激活与内源性抗氧化系统增强密切相关，正常生理条件下，Nrf2与Kelch样ECH相关蛋白(Keap)1相耦联位于细胞质中，无生物活性；而氧化应激发生时，Nrf2可发生磷酸化与Keap1解耦联并转移入核，进而与DNA上氧化反应元件(ARE)启动HO-1、SOD、GSH-PX等下游抗氧化酶表达，引发抗氧化反应〔16，17〕。研究表明，Nrf2抗氧化通路在大鼠急性肝损伤中发挥重要保护作用，激活Nrf2信号通路可减轻化学性肝损伤，该通路可作为肝损伤治疗靶点〔18～20〕。本研究结果提示HFE保护CCl4诱导的大鼠肝损伤作用可能与Nrf2通路激活有关。HFE可通过促进Nrf2通路激活减轻CCl4诱导的大鼠急性肝损伤，但HFE作为一种中药提取物，可能具有多靶点活性，可能还通过调节其他相关通路共同发挥抗氧化作用，减轻肝损伤，但有待进一步探究。

综上所述，HFE可通过促进Nrf2通路激活，发挥抗氧化应激作用，减轻CCl4诱导的大鼠急性肝损伤。但HFE作为一种中药提取物，可能具有多靶点活性，在减轻肝损伤作用过程中还可能通过调节其他相关通路共同发挥抗氧化作用，有待进一步深入探究。