玉米杂种优势类群划分高多态SSR引物筛选

巴爱丽，杨 靖，贾菲芸，樊苗苗，张 冉，李友勇

(河南科技学院生命科技学院/现代生物育种河南省协同创新中心，河南新乡 453003)

0 引 言

【研究意义】玉米杂种优势类群是现代玉米品种改良的重要概念之一[1,2]。划分玉米自交系的杂种优势群，早期主要使用系谱法和测交法[2-4]，20世纪80年代开始应用SSR分子标记法[5]，2000年后单核苷酸多态性SNP(Single nucleotide polymorphism )分子标记法得以应用[6]。系谱法和测交法目前更多的是用于验证分类；SNP分子标记法，具高通量，是目前玉米自交系杂种优势群划分的先进方法，但SSR分子标记方法准确、简便、低成本，仍是目前常用方法。【前人研究进展】SSR分子标记划分类群，早期引物体系中的引物数量较多，有70对到90对[7-10]，后来多用40对[11-13]，也有使用30对和20对体系划分报道[14-17]。但在应用这些引物体系时，部分引物的PIC值(多态信息含量，polymorphism information content)下降，多态性变差。【本研究切入点】SSR分子标记体系是一个高可靠性、低成本的玉米杂种优势群划分工具，但部分引物多态性在新选育的自交系中常有降低改变。建立新引物体系，需要筛选高多态引物,重新在玉米染色体上遴选均匀分布的SSR，包括过去常用的核心SSR，在已知类群的自交系中测试分类，筛选高多态引物，构建新引物体系。【拟解决的关键问题】 遴选均匀分布在玉米10个连锁群上160对SSR引物，在104份玉米自交系DNA中扩增，检测过去的核心引物在新培育的自交系中PIC值的稳定性，重新利用高PIC值引物建立新引物体系。

1 材料与方法

1.1 材 料

自交系多数属黄淮地区种质，一部分系是类群的代表自交系，如郑58、昌7-2、B73、PH6WC、PH4CV、E28等，另一大部分是近些年改良的自交系，亲缘关系已知，并经多代测交，所属类群基本明确。国内玉米自交系杂种优势群及其代表自交系近些年有所变化，类群及代表自交系的种质体系是：黄改群(Improved Huang)，即四平头群，过去的代表自交系是黄早4，试验代表自交系是昌7-2、浚92-6、浚92-8等；瑞德群和改良瑞德群在不同时期内涵不一，早期的改良瑞德群(Improved Reid)[3]，也称PA[4]，也有称瑞德的[10，13]，也有报道把瑞德和改良瑞德分开了，瑞德群(Reid)，指未被改良或改良程度较低的美国等地来源自交系，代表自交系过去是B73，目前先玉335母本PH6WC也在其中[12]；改良瑞德群指过去典型代表自交系掖478改良演化的类群，目前代表自交系是郑58及相近系[11,13]。兰卡斯特群(Lancaster，也常称兰卡等)，名称没有变化，典型代表自交系过去是MO17，目前先玉335父本PH4CV血缘的自交系也属该类群[13,18]。旅大红骨(Lvda-Red-Cob)，也常称旅群、旅系，类群的名字和内涵没有变化，但黄淮地区利用的杂交种中该类群的种质比例已较小，仅有E28、W245等少数几个系。表1

表1 104份玉米自交系名称及种质亲缘Table 1 The names of 104 maize inbred lines and their germplasm relatives

续表1 104份玉米自交系名称及种质亲缘Table 1 The names of 104 maize inbred lines and their germplasm relatives

1.2 方 法

1.2.1 SSR扩增

SSR引物选取已报道的核心SSR引物[6-8,10,12,13,18]，从玉米SSR标记库(http://www.maizegdb.org/ssr.php)中遴选补充。按4倍量遴选引物，共160个，每个染色体上16个，均匀分布，标记引物由上海生工生物技术有限公司合成。

DNA提取的材料处理方法参考玉米SSR技术标准[11,19]，自交系种子在25～28℃培养室中发芽，幼芽长至5～8 cm，取6～10株幼苗叶片，剪0.5 cm小段，混合均匀称取0.25 g，CTAB法提取总DNA[13,14]，纯度和浓度检测使用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法[12,20]。

PCR扩增技术标准使用10 μL反应体系[11,19]：灭菌超纯水6.38 μL，10×Buffer(Mg2+)1 μL，dNTP(2.5 mM)0.8 μL，TaqDNA Polymerase(5 U/μL)0.12 μL，DNA模板(50 ng/μL)0.8 μL，引物(10 μmol/L)0.8 μL；PCR扩增程序：94℃预变性3 min，35个循环，每个循环94℃变性1 min，55～69℃(根据引物确定)退火1 min，72℃延伸2 min；45个循环，72℃延伸10 min。扩增结束后4℃保存，8%变性聚丙酰胺凝胶75W电泳1 h左右，银染显色[11～14]。

1.2.2 遗传参数

PCR扩增产物读带参考李玥等[20]方法，在凝胶相同位置，有条带标记为1，无条带标记为0，缺失标记记为-9，读取的基因型建立遗传相似系数矩阵，PowerMarkerV3.2[21]计算各引物在自交系间的多态信息指数PIC，NTSYS-pc2.10软件[22]对遗传相似矩阵进行中心化处理，UPGMA方法层次聚类分析，Structure2.3.1软件[23]处理遗传相似系数矩阵，K值分析法估算各自交系群体遗传结构数值。

2 结果与分析

2.1 高多态引物筛选

研究表明，其中63对引物扩增的带型清晰，分离良好，基因型多态性丰富，有4-7个等位基因，该63对引物与过去报道的核心引物体系比较对照，保留比例30%～40%。图1

图1 两个引物(a, bnlg1702，和b, umc1084)在部分玉米自交系DNA中的扩增SSR图谱Fig.1 SSR gel graphs amplified by both of primers(a, bnlg1702, and b, umc1084) in DNA of partial maize inbred lines

2.2 新引物体系遴选

研究表明，40对引物分类42份自交系为4大类群，分别是瑞德、改良瑞德、兰卡斯特和黄改，各群内的自交系数目与已知类群中的自交系数目完全一致；30对体系结果与40对体系比较有2个材料差异，差异比率4.76%；20对体系有4个材料变化，差异比率9.5%；10对体系的结果在4个群中有7个材料变化，差异比率为16.7%。表2，表3

表2 遴选的4套引物及遗传参数Table 2 Selected 4 sets of primers and their genetic parameters

表3 4套引物体系分类42份玉米自交系的类群及类群内的自交系数目Table 3 The groups and the number of inbred lines in each group, classification of 42 inbred lines by 4 sets of primer systems

2.3 新引物体系的应用聚类

研究表明，在0.30距离位置的二级分类下，104份材料被划分为4大类群，在0.32距离的三级分类下，自交系被划分为5大类群，二级分类中没有划分出的旅大红骨在三级分类下出现。主群下均有1个小亚群，自交系数量不多，但与群内多数成员距离较远，如与兰卡相近的拟兰卡群，与瑞德相近的拟瑞德群，以及拟黄改群等，根据材料来源，这些亚群中的成员多是主群内和相近群间杂交后纯合的混合种质，被聚类为独立亚群，引物体系的高分辨率。20对引物体系的分类结果与40对引物体系比较，群中的多数材料仍保持一致，划分结果不同的自交系有8个，分别是易选-2、W246、郑22优、D2-5、543PH6、12Y09、CPH4CV和FW1，占材料总数的7.69%，是混合型种质。图2

图2 40对引物分类104份玉米自交系聚类Fig.2 Cluster graph of 104 maize inbred lines classified by 40 pairs of primers

2.4 新引物体检测系的群体遗传结构

研究表明，当类群数(K值)设1～15，△K值在K=4时达到最大值，即材料主体为4大种质类群，与层次聚类结果的类群数一致。K=9时，△K值有一个小的峰值，反映主群下亚群种质差异。4个类群是反映该104份自交系的群体最优遗传结构，9个类群能反映较细节差异，因7个类群即可识别旅大红骨群，设K=7，计算各自交系的遗传组成，典型类群代表自交系，如郑58、昌7-2、PH6WC、PH4CV、E28等，均是所属群体的单一成分；主群下亚群的自交系，则是非单一成分，如小亚群中的登海516父本PHBIM，遗传结构中瑞德0.506 5，旅大红骨0.336 7；迪卡517父本的改良系W517F，兰卡0.288 9，黄改0.446 5，还有20对引物与40对引物分类中改变类群的自交系，易选-2、郑22优、D2-5、543PH62、12Y09、CPH4CV和FW1，均是多遗传结构成分。图3,表4

图3 40对引物体系检测的104份玉米自交系群体结构Fig.3 The population structure of 104 maize inbred lines detected by 40 pairs of primers

表4 104份材料中部分典型自交系的群体遗传组成Table 4 Population genetic composition of partial of 104 inbred lines

续表4 104份材料中部分典型自交系的群体遗传组成Table 4 population genetic composition of partial of 104 inbred lines

3 讨 论

实验结果的63对高多态引物中，过去的引物保留40%左右；当高多态引物数量大于引物体系引物数量时，引物体系不是唯一的，可在高PIC值引物间随机组合，特定地区、特定时期的玉米自交系的高PIC值引物可能不同，能筛选出新的高PIC值特定引物体系。

自交系分类结果是直观的，但要判断两自交系间遗传差异，群体遗传结构结果更重要。那些单群体结构成分自交系，如类群代表自交系，其类群和群体结构是一致的，不同引物体系划分的类群一般也比较稳定，群间遗传差异明确；但多群体结构成分自交系，类群和群体结构不完全一致，比较不同个体遗传差异时，往往要比较类群结构成分，这些个体在不同的材料体系和不同引物体系中，其类群易变，群体结构成分也易变。但这些材料，多态位点多，创新性强，正确组配可能产生创新组合，甚至新杂优模式。Zhang等[24]检测到郑58中有旅群“单340”来源的遗传成分，赵久然等[25]在解析京科968等玉米新组合杂优模式时认为母本是一个新类群，称X群。检测和认识新材料的类群和群体结构，需要不断筛选和建立新的引物体系，使检测的结果更准确，更有指导价值。

4 结 论

在包括常用核心引物在内的160对引物中筛选高多态引物63对，按染色体分布和PIC值遴选的40对引物体系，能正确识别国内各类群代表自交系的遗传多态性，也能有效识别混合种质基因型，是一个分类精度较高的新引物体系，适用于新玉米自交系类群的划分；20对引物体系，能达到40对体系的92.3%的分辨率，虽稍低，但检测工作量减半，在批量材料分类中有利用价值。