高糖、高胰岛素环境成骨细胞Glut4表达对成骨功能的影响

司晶殊 奚悦

(锦州医科大学附属第三医院 1营养科，辽宁 锦州 121000；2内分泌科)

糖尿病是全世界范围内的常见病，目前估计成年人中1型和2型糖尿病的全球患病人数接近4.25亿，预计到2045年将增加到6.29亿，这意味着每11名成年人中就有1人患有糖尿病〔1〕。目前糖尿病骨质疏松的发病机制尚未阐明，虽然半个世纪以前就已发现糖尿病可引起骨量改变，但近10年糖尿病才被视为骨质疏松发生的独立危险因素，据统计全球约4%的骨质疏松性骨折归因于糖尿病，然而，考虑到糖尿病患病率的增加及它可能与伤害性跌倒的更大风险相关的事实，其实际比率可能更高〔2〕。

成骨细胞在骨重塑过程中扮演着重要角色，包括合成分泌骨基质，促进骨形成及基质矿化，调节破骨细胞分化及骨吸收及完成骨骼内分泌功能，成骨细胞功能的研究对探讨糖尿病骨质疏松发生机制有着非常重要的意义，成骨细胞分泌两种重要的功能蛋白，Ⅰ型胶原蛋白(CoiⅠ)和骨钙素(BGP)，CoiⅠ是骨基质中最丰富的有机胶原蛋白质，赋予骨骼机械弹性，BGP是成骨细胞活性标志物，在基质中增加游离钙离子及羟基磷灰石的亲附性，维持骨的正常矿化，未羧化的BGP进入血液循环，行使内分泌激素的作用。葡萄糖转运体(Glut)是介导葡萄糖进入细胞的转运载体，在成骨细胞中表达3种高亲和力的Glut：Glut1，Glut3和Glut4，在成骨细胞分化过程中Glut1和Glut3的水平保持恒定，Glut4是成骨细胞后期分化所必需的，随着成骨细胞分化和胰岛素刺激的葡萄糖氧化而增加，是胰岛素依赖的葡萄糖转运蛋白〔3〕。

细胞作为能量代谢的基本单位，调节燃料的选择、分配、利用以适应细胞增殖，分化和代谢等能量需求，保证各组织器官发挥正常生理功能和机体的能量平衡，本研究旨在观察高糖、高胰岛素环境成骨细胞Glut4、BGP、CoiⅠ等蛋白的表达情况并探讨成骨细胞葡萄糖代谢对成骨功能的影响。

1 材料和方法

1.1主要试剂和仪器 胎牛血清(FBS)(浙江天航生物科技股份有限公司)、最低必需培养基(MEM)-α培养基(HyClone公司)、Glut4小鼠单克隆抗体(Proteintech公司)、GAPDH单克隆抗体、羊抗鼠LgG抗体(中国武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)、BGP酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、CoiⅠ ELISA试剂盒(江苏酶标生物科技股份有限公司)、胶原酶Ⅱ、维生素C、β-甘油磷酸钠、碱性磷酸酶染色试剂盒、茜素红S染色液、苏木素染液、细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司)、胰酶细胞消化液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术公司)、高敏型电化学发光(ECL)试剂盒(诺唯赞生物)、门冬胰岛素注射液(诺和诺德中国制药有限公司)、CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)、 超净工作台(美国NUAIRE公司)、倒置相差荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.2原代成骨细胞提取 昆明小鼠乳鼠(出生≤5 d)购自锦州医科大学动物实验中心，并经锦州医科大学实验动物管理委员会批准，每次提取10只。参考文献〔4〕采用胶原酶消化法提取昆明小鼠乳鼠颅骨成骨细胞，提取后接种于含10%FBS的MEM-α培养基(青霉素100 μg/ml，链霉素0.1 mg/ml)10 cm培养皿中，于37℃，5%CO2培养箱中孵育。

1.3原代成骨细胞体外传代培养及诱导分化 倒置显微镜下观察细胞已铺满培养皿底壁，密度达到90%以上，用胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液消化细胞，显微镜下观察细胞皱缩，变圆变亮，部分细胞已从皿底壁脱离，加入完全培养基终止消化；轻轻吹打细胞转移至离心管中，离心后重悬细胞，按1∶3比例传代，提取的原代小鼠成骨细胞首次传代之后给予诱导培养基诱导培养，诱导培养基为含10%FBS、 50 μg/ml维生素(Vit)C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、青霉素100 μg/ml，链霉素100 μg/ml的MEM-α培养基。

1.4原代成骨细胞碱性磷酸酶染色 原代成骨细胞体外诱导培养14 d左右行碱性磷酸酶染色，染色前把细胞接种于24孔板中，细胞贴壁密度达到60%左右按照试剂盒说明书操作步骤进行染色，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定，湿盒孵育，核固红复染细胞核，奥林巴斯显微镜拍照并保存图片。

1.5原代成骨细胞茜素红S染色 原代成骨细胞诱导培养21 d左右行茜素红S染色，染色前把细胞接种至24孔板中，细胞贴壁密度达到90%以上时按照试剂盒说明书操作步骤进行染色，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定，茜素红S染色液染色，奥林巴斯显微镜拍照并保存图片。

1.6实验分组 分为4组：正常对照(N)组，培养基中葡萄糖浓度为5.5 mmol/L；高糖(T)组，培养基中葡萄糖浓度为25 mmol/L；高胰岛素(Y)组，培养基中胰岛素浓度为1 μmol/L；高糖高胰岛素(D)组，培养基中葡萄糖浓度为25 mmol/L，胰岛素浓度为1 μmol/L，分别诱导6 h和24 h进行实验。

1.7Western印迹检测Glut4蛋白表达 各组细胞分别诱导6 h和24 h后收集细胞，冰上裂解细胞〔RIPA 裂解液：苯甲酸磺酸氟(PMSF)=100∶1〕提取蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，根据十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)配制试剂盒说明制胶，上样电泳分离蛋白，然后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDG)膜上，5%脱脂奶粉封闭后，GAPDH、Glut4一抗4℃孵育过夜，次日TBST洗膜，再用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠二抗室温孵育后，TBST洗膜ECL液显影，用Imageproplus6.0软件扫描各组细胞条带的灰度值，以GAPDH作为内参，计算Glut4的蛋白质的相对表达量，每组重复3次。

1.8ELISA检测BGP、CoiⅠ含量 每组蛋白样品设置3个重复孔，按照试剂盒说明书操作步骤进行实验，以空白孔调零，450 nm波长检测各孔的吸光度OD值，绘制标准曲线，得出直线方程，根据方程计算各组蛋白样品BGP、CoiⅠ含量。

1.9统计学分析 采用SPSS21.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1原代成骨细胞形态 奥林巴斯显微镜下观察原代成骨细胞生长情况，可见体外生长2 d细胞体积较小，呈梭形、三角形、立方形；体外生长5 d后细胞体积逐渐增大，立方形、三角形细胞逐渐增多，细胞核明显，细胞伸出突起与周围细胞连接；体外培养12 d，细胞体积明显变大，呈立方形、三角形，胞核明显，胞质丰富，细胞伸出较多突起，呈分层重叠生长，见图1。

图1 原代成骨细胞第1、5、12天 细胞生长变化(×40)

2.2原代成骨细胞碱性磷酸酶染色 原代成骨细胞体外传代培养逐步诱导分化成熟，在细胞功能成熟早期胞质合成分泌碱性磷酸酶，被染成蓝色，并可见蓝色碱性磷酸酶颗粒，核固红复染胞核呈红色，奥林巴斯显微镜下观察，原代成骨细胞碱性磷酸酶染色阳性率>95%，碱性磷酸酶染色鉴定原代提取成骨细胞生长分化良好，见图2。

图2 原代成骨细胞提取后第14天ALP染色

2.3原代成骨细胞茜素红S染色 原代成骨细胞体外诱导分化成熟，基质被矿化，在骨基质中形成钙化结节，茜素红S可与基质磷酸钙中的钙盐螯合形成橙红色的复合物，经茜素红S染色后，在奥林巴斯显微镜下观察可见橙红色钙化结节，结节周围成骨细胞呈同心圆排列，经茜素红染色鉴定原代提取成骨细胞分化成熟，见图3。

图3 原代成骨细胞提取后第21天茜素红染色(×40)

2.4Western印迹检测原代成骨细胞Glut4蛋白表达 细胞诱导6 h，与N组相比，Y组、T组、D组细胞Glut4蛋白表达明显增加(P<0.05)。在诱导24 h后，与T组相比，N组细胞Glut4蛋白表达明显减少，Y组细胞Glut4蛋白表达明显增加(P<0.05)，D组与N组比较无明显差异(P>0.05)，见表1、图4、图5。

表1 各组细胞诱导不同时间Glut4相对表达量

图4 各组细胞诱导6 h Glut4蛋白表达水平

2.5ELISA检测原代成骨细胞BGP、CoiⅠ蛋白含量 在高胰岛素、高糖诱导6 h，与N组相比，T组、D组 BGP分泌明显增加(P<0.05)，24 h后与N组相比，Y组BGP分泌明显增加，N组BGP分泌明显减少(P<0.05)，D组与N组相比无明显差异(P>0.05)；在高糖、高胰岛素诱导不同时间，与N组相比，T组、Y组、D组CoiⅠ分泌无显著差异(P>0.05)，见表2。

图5 各组细胞诱导24 h Glut4蛋白表达水平

表2 不同诱导时间各组细胞BGP、CoiⅠ蛋白含量比较

3 讨 论

最近的研究表明无论是1型还是2型糖尿病都引起骨质量的恶化和机械性能的减弱，导致糖尿病骨质疏松和脆性骨折风险性增加〔5〕,健康的骨骼由骨重塑的细胞机制来维持,成骨细胞作为骨重塑过程中的主要造骨细胞，揭示支持其特异性生理活性的生物能学对研究糖尿病骨质疏松发生机制有着非常重要意义。

葡萄糖是大多数细胞主要的能源和碳源，葡萄糖也是成骨细胞的主要营养素和能源底物〔6〕，不仅如此，成骨细胞对葡萄糖的利用是整个机体的能量稳态的决定因素〔7〕。成骨细胞葡萄糖代谢与成骨细胞整个生命过程中能量需求、生理功能相适应，研究证明，成骨细胞分化的不同阶段利用氧化磷酸化和糖酵解产生三磷酸腺苷(ATP)〔8,9〕。成骨细胞选择产生ATP的方式，可能更有利于成骨细胞生物蛋白的合成，已证明葡萄糖碳对胶原蛋白中的氨基酸生成有重要作用〔10〕，亦可能与柠檬酸盐的大量合成和主动分泌有关，而柠檬酸盐对于骨骼中形成磷灰石纳米晶体具有重要的意义〔11,12〕。

成骨细胞通过质膜上Glut将葡萄糖顺浓度梯度转移到细胞中，研究表明Glut1介导成骨细胞以恒定的方式摄取葡萄糖，Glut4是在成熟成骨细胞上表达，是以胰岛素依赖的方式吸收葡萄糖的主要载体，在基质生成和矿化相关的能量需求中发挥重要作用〔13〕，在小鼠原代成骨细胞中Glut4是胰岛素依赖的葡萄糖摄取所必需的〔3〕。BGP是成骨细胞合成并分泌到基质的特异蛋白质，在骨形成过程中基质矿化所必需的。胰岛素可能通过胰岛素受体IR-FoxO1信号转导促进BGP的分泌〔14〕，最新的研究发现一个新的成骨细胞特异性基因ESP，该基因编码被称为OST-PTP的酪氨酸磷酸酶，OST-PTP使胰岛素受体去磷酸化，此段基因的敲除可导致成骨细胞增加胰岛素信号传导和BGP产生〔15〕，而Glut4是胰岛素信号通路的主要效应蛋白，由此可以得出特异的基质蛋白BGP分泌与葡萄糖代谢关键蛋白Glut4表达相一致，Glut4的表达调节了BGP的分泌，在Glut4与BGP之间存在着分子信号通路的连接。

本研究中T组Glut4表达和BGP分泌先增加并随着诱导时间的延长而减少，考虑成骨细胞最初由于细胞外环境中葡萄糖浓度的骤然增加，Glut4顺浓度梯度增加葡萄糖转运伴随BGP分泌的增加，BGP作用于胰腺-骨骼内分泌环，增加胰岛素分泌，改善成骨细胞对葡萄糖的利用，降低细胞外葡萄糖浓度，有利于维持成骨细胞基质合成和矿化，由于本研究为体外实验不能通过反馈作用调节胰岛素的分泌，持续的高糖环境降低了成骨细胞的活性，抑制Glut4表达和BGP分泌，量化为骨形成的减少，这可能与高糖干扰成骨细胞磷脂酰肌醇-3肌酶-蛋白激酶B-内皮型一氧化氮合酶(PI3K-AKT-eNOS)信号通路转导有关，并与相关研究报道相一致〔16～18〕。

CoiⅠ是成骨细胞最早合成分泌的蛋白质，是骨骼基质主要成分，CoiⅠ的合成先于成骨祖细胞分化的最早转录决定因子Runx2的表达，且不受Runx2的调控，成骨细胞分化与CoiⅠ合成之间的脱节可以由成骨细胞生物能学来解释，Glut1的表达更先于Runx2的表达，成骨细胞通过Glut1以胰岛素非依赖性方式摄取葡萄糖，成骨细胞中的葡萄糖摄取促进成骨细胞分化和骨形成，Runx2的启动又协同调节Glut1表达和CoiⅠ合成〔19〕。本研究结果与之前实验结果〔4〕相一致，同时进一步印证了之前的研究结果，Glut1介导的葡萄糖摄取和CoiⅠ合成与Runx2之间的相互作用贯穿于整个成骨细胞分化和骨骼形成过程中〔19〕；并且可能解释了糖尿病患者骨骼脆性和骨折风险性增加，而骨密度(BMD)可表现为正常、增高或减少的不同临床表现，因为骨重塑过程中改建更少的骨骼意味着有更多时间进行胶原蛋白交联和更完整的次生矿化，导致骨质流失和结构性恶化，最终损害骨骼的质量，引发糖尿病骨质疏松〔20〕。同样研究显示甲状旁腺激素(PTH)通过增加成骨细胞葡萄糖代谢，改善成骨细胞葡萄糖利用，促进了成骨细胞蛋白质合成,已经应用于骨质疏松的治疗〔21〕。

综上，成骨细胞的功能与自身葡萄糖代谢有着独特的关系，成骨细胞通过响应生物能机制以适应其增殖、分化、基质合成和矿化的生理要求，实现细胞能量代谢和细胞生物功能的耦合。CoiⅠ的合成与Glut1表达密切相关，而在成熟的成骨细胞Glut4发挥调节BGP分泌的作用，参与整个机体的能量代谢和能量循环中，阻止糖尿病骨质疏松骨骼微结构和骨质量的恶化，葡萄糖代谢关键蛋白分子Glut4有望成为糖尿病骨质疏松治疗的新靶点。