肝肠钙黏连蛋白与胃癌临床预后关系及对癌细胞BGC823生物学行为的影响

樊建平 赵玉军 钱军

(衢州市人民医院胃肠外科，浙江 衢州 324000)

胃癌是一种发病率高、癌转移率高、致死率高的消化系统恶性肿瘤之一〔1，2〕，属于器质性疾病，发病机制十分复杂。尽管目前的外科手术和化疗手段不断进步，但胃癌的死亡率仍居高不下，胃癌患者的5年生存率远低于30%〔3〕。胃癌细胞的恶性转移成为影响治疗成功与否的关键因素〔4〕。研究证实〔5〕因胃癌的局部复发或远处转移导致死亡的患者逐年上升。因此，探究与胃癌的病程发展相关的分子及作用机制在胃癌的诊断和治疗中具有重大价值。肝肠-钙黏连蛋白(CDH17)是新近发现的钙黏蛋白(CAD)超家族的新成员，属于一种钙离子依赖性的细胞黏附蛋白，在正常生理状态下仅在肝、肠组织中定位表达〔6〕。研究〔7〕显示CDH17在胃癌中过表达，并且与肿瘤的恶性转移与侵袭关系密切。Lee等〔8〕研究表明在早期胃肠系统中，CDH17的异常表达是胃肠腺体肿瘤的标志物。Lin等〔9〕研究证实沉默CDH17的表达后明显抑制胃癌细胞的淋巴转移，提高胃癌患者生存率。因此，本研究通过对临床上胃癌组织样本及胃癌细胞株BGC823的研究，探讨CDH17的表达对胃癌细胞侵袭及迁移的作用机制，以期为临床上胃癌的靶向治疗提供新的实验数据。

1 材料和方法

1.1胃癌组织标本的选取及临床资料 选取2012年3月至2014年3月在衢州市人民医院进行手术切除的80例胃癌患者(男28例，女52例，患者年龄38～72岁，中位年龄51岁)的癌组织及对应的癌旁组织(距离癌组织超过2.5 cm)作为研究对象，同时收集胃癌转移淋巴组织标本45例，入选患者术前均未接受放化疗干预，均是首次手术切除病灶，组织病理学确诊为原发性胃癌，并纳入相关性研究。本研究经医院伦理委员会批准，患者或其家属均对本研究的目的知情，并签署同意书。以定期门诊复查和电话相结合的方式对患者进行5年随访，总生存期(OS)为从手术开始至患者死亡或随访结束。

1.2实验材料与方法

1.2.1实验动物 30只，6～8周龄雄性 SD 裸鼠，SPF级，体重(150±30)g，由衢州市人民医院基础实验动物研究中心从浙江海隆生物科技有限公司采购，动物的使用许可证号：SYXK(浙)2019-0024。

1.2.2细胞、试剂及主要仪器 人胃癌细胞BGC823从美国菌种保藏中心ATCC采购。过表达rAAV9-CDH17及阴性对照rAAV9-CDH17-NC由上海吉玛科技公司提供。DMEM培养基(美国HyClone公司)；膜联蛋白(ANX)A4，ANXA7抗体、兔抗大鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)，Transwell小室(美国Santa Cruz公司)；Western印迹试剂盒(美国sigma公司)，免疫组化试剂盒、全蛋白抽提试剂盒(上海生工生物科技公司)，Lipofectamine3000转染试剂(美国Corning公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，上海碧云天生物技术公司)。无菌生物工作台(北京泰克仪器厂)，恒温恒压多功能细胞培养箱(上海力新仪器有限公司)；5810R 型高速离心机(日本岛津公司) 。

1.3方法

1.3.1免疫组化法检测CDH17蛋白的表达 将各样本常规固定，按免疫组化试剂盒要求进行包埋、切片、修复、浸泡、封闭，染色，复染，脱水，干燥、封片后镜检。切片结果经病理科两位医师根据染色面积(面积范围≤10%计为0分，>10%且≤25%计为1分，>25%且≤50%计为2分，>50%且≤75%计为3分，>75%计为4分)及染色强度(细胞无染色计为0分，弱黄色计为1分，黄色染色计为2分，棕黄色计为3分)进行评分，两者积分之和≥3分则为CDH17蛋白阳性表达，<3分则为CDH17蛋白阴性表达。

1.3.2细胞复苏、培养以及分组处理 将人胃癌细胞BGC823细胞复苏，接种于DMEM培养基中，37℃，5%CO2条件下恒温恒压多功能细胞培养箱进行培养，当细胞的生长密度超过85%时，消化传代。进行实验。细胞分为正常组(仅有BGC823细胞，细胞培养基中只加入Lipofectamine3000试剂)、对照组(BGC823细胞经Lipofectamine3000试剂转染100 nmol/L 的rAAV9-CDH17-NC)、实验组(BGC823细胞经Lipofectamine3000试剂转染100 nmol/L 的rAAV9-CDH17)。

1.3.3Transwell小室实验检测各组细胞的迁移和侵袭能力 迁移实验：在Transwell小室的上室底部铺一层不含血清的40 μl基质胶，细胞分组处理同上，消化细胞并用1 ml的PBS清洗2遍后，同时用无血清RPMI1640培养液将细胞稀释至1×105个/ml，加200 μl细胞悬液到Transwell上室，加500 μmol/L 含20%胎牛血清(FBS)的RPMI1640到Transwell下室，严格按试剂盒要求进行细胞培养、染色，镜检并拍照，采用ImagePro Plus6.0对图片进行细胞计数。侵袭实验与迁移实验相同，但不铺基质胶。

1.3.4裸鼠皮下成瘤实验 调整细胞浓度，以1×105个/孔接种于96孔培养板中，分组处理同上，置入在恒温恒压多功能细胞培养箱37℃继续培养，待细胞生长密度达到1×106个/ml时，消化细胞，离心5 min，弃掉上清液，加入500 μl PBS，避光放置于冰上，使用1 ml 注射器分别将胃癌细胞悬液注射进预先麻醉好的裸鼠右前肢皮下。接种第5天后连接活体成像系统(IVIS)。留取大鼠皮下成瘤瘤组织转移图像。7 w后颈部放血处死裸鼠，收集皮下成瘤的标本，称量质量同时留取记录。

1.3.5Western印迹检测各组细胞中CDH17、ANXA4、ANXA7的表达水平 调整细胞浓度按1×105个/孔接种至6孔板中，分组处理同上，置入恒温恒压多功能细胞培养箱继续培养3 h，加入细胞裂解液，提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量。每个样本取50 μg样品，进行凝胶电泳后，转膜，室温封闭1 h ，分别加稀释好的一抗，4℃过夜孵育。次日，取出恢复至室温，聚丁二酸-共-对苯二甲酸丁二醇酯(PBST)充分洗膜，加适量稀释好的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温震荡1 h，PBST洗膜，加电化学发光(ECL)进行显色，拍照及灰度扫描，最后以GAPDH作为内参蛋白，用Image J 软件分析各条带的灰度值。

1.4统计学分析 采用SPSS19.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1免疫组化法检测CDH17蛋白的表达 CDH17在癌旁组织中以阴性表达为主；CDH17在胃癌组织以阳性表达为主，阳性表达率78.75%，且CDH17的表达主要定位在细胞膜及细胞质中；CDH17在胃癌转移淋巴组织中以阳性表达为主，阳性表达率高达88.89%。见图1。

图1 免疫组化检测标本中CDH17的表达(SP，×400)

2.2CDH17的表达与胃癌的临床病理指标的相关性分析 不同性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度患者CDH17表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；不同淋巴结转移、浸润深度、TNM分期患者CDH17表达差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同临床病理特征患者CDH17表达比较〔n(%)〕

2.3不同CDH17蛋白表达程度胃癌患者生存分析 CDH17阳性患者(n=63)5年生存率为22.22%，阴性表达患者(n=17)5年生存率为41.35%，两者差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 不同CDH17蛋白表达程度与胃癌患者生存分析

2.4Transwell小室实验检测各组细胞的迁移和侵袭能力 与正常组相比，实验组细胞迁移个数和通过基质胶的个数明显增多(P<0.05)；正常组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表2。

2.5CDH17对裸鼠成瘤的影响 与正常组相比，实验组裸鼠内移植瘤的明显变大，瘤体重量明显增加(P<0.05)；与正常组相比，实验组裸鼠内移植瘤瘤体淋巴转移的病灶比例明显增加(P<0.05)；正常组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图4、图5。

图3 Transwell小室实验检测各组细胞的迁移和侵袭能力(结晶紫染色，×400)

表2 各组细胞迁移和侵袭的数量(个，

表3 瘤体质量和淋巴转移比例

图4 CDH17对裸鼠成瘤瘤体转移的影响

图5 CDH17 对裸鼠成瘤的影响

2.6CDH17与ANXA4、ANXA7蛋白的关系及表达水平 与正常组相比，实验组细胞中CDH17、ANXA4、ANXA7的表达水平明显上升(P<0.05)；正常组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图6。

表4 各组细胞中CDH17，ANXA4， ANXA7的相对表达量

图6 各组CDH17、ANXA4、ANXA7蛋白表达

3 讨 论

Wang等〔10〕研究证实胃癌细胞的恶性转移和侵袭是胃癌预后差的关键因素。胃癌细胞具有较强的侵袭和迁移能力，促使胃癌早期即发生转移，或者在转移过程中胃癌细胞会发生进一步变化，导致化疗失败，诱导胃癌复发或者更深层的转移〔11〕。

研究表明〔12〕胃癌细胞的转移与侵袭过程中，黏附分子介导的细胞黏附力降低是至关重要的环节。已证实〔13〕钙黏蛋白介导的细胞黏附在胃癌细胞的转移与侵袭中发挥着关键作用。CDH17定位于8q22.1染色体上，是由832个氨基酸构成的跨膜蛋白。已有的研究证实〔14〕，CDH17在胃正常组织中基本不表达，在胃肠系统腺体癌中高表达，本研究与之一致。本研究结果推断CDH17的阳性表达可能与肿瘤细胞的侵袭有关。Jin等〔15〕研究表明CDH17的表达上调能增加胃腺癌的转移率，降低胃癌患者的生存率，起到关键的促癌作用。Bartolomé等〔16〕研究证实下调CDH17能明显降低结肠癌细胞和肝癌细胞的增殖，起到明显的抑癌作用。这可能与CDH17在不同肿瘤中所起的作用不同或不同组织中CDH17与不同的特异性结合分子结合产生的效应不同有关。本研究结果表明过表达CDH17后，胃癌细胞BGC823细胞的迁移和侵袭能力明显降增强；体外裸鼠成瘤实验结果显示CDH17的促癌作用。

转移和侵袭是恶性肿瘤的基本生物学特征，这过程中涉及多种蛋白因子相互协调共同作用完成〔17〕。ANXA4和ANXA7是一类与钙离子特异性结合的钙依赖性磷脂蛋白。膜联蛋白结构上含有可变的N-末端结构域，依靠该结构域的变化，膜联蛋白能直接参与细胞膜的形成、转运、信号转导及细胞增殖、分化和凋亡等生物学细胞活动〔18〕。ANXA4和ANXA7作为细胞表面受体，一方面可与组织型纤维蛋白溶解酶原激活物及纤溶酶原特异性结合生成纤溶酶，促进纤维蛋白的降解；另一方面能够激活内皮细胞的纤溶酶原促进金属蛋白和多种膜蛋白的水解，细胞外基质的降解，加速肿瘤的血管新生推动肿瘤细胞的浸润和转移〔19〕。有研究证实〔20〕ANXA4和ANXA7在胃癌对淋巴转移过程中发挥了重要作用。本研究结果表明推断CDH17可能通过调控ANXA4、ANXA7的表达来影响胃癌细胞的转移和侵袭。

综上，CDH17在胃癌中呈高表达，并且能够促进胃癌细胞823的迁移和侵袭，这可能与CDH17能够调控ANXA4，ANXA7的表达有关。但是CDH17能否通过调控其他蛋白因子的表达来影响胃癌细胞的转移和侵袭，还需进一步的研究。