LncRNA p21通过介导Wnt/β-catenin信号通路在调控胃癌转移中作用和机制

徐建国 曹洪涛 张子龙 冀保妍 王春秋 李生栋 刘国庆

(青海省人民医院 1肿瘤外科，青海 西宁 810001；2消化内科)

胃癌在临床中属于较为常见的恶性肿瘤疾病，其发病机制与个人生活习惯、遗传因素及幽门螺杆菌等相关因素有关，但目前已有研究证实东部沿海地区和西北地域病发胃癌发生率明显高于南方〔1，2〕。世界卫生组织报道2018年全球共计新发胃癌患者为100万例，在诸多癌症中胃癌发病率占第5，死亡率占第3，且男性发病率高于女性〔3〕。研究发现我国胃癌发病率占全球的40%以上，且仅2014年新发胃癌41万例，占诸多癌症的10.79%。早期确诊胃癌治疗5～10年生存率高达95%，因此早期确诊可有效提高患者生存率，且有效的肿瘤标志物对患者病情的判断和临床预后具有重要应用价值〔4〕。胃癌在临床中涉及多种生物学和分子事件，且潜在生物标志可有助于制定胃癌治疗计划。长链非编码RNA(LncRNA)在诸多肿瘤疾病中均有参与表达，且有研究证实LncRNA参与了胃癌的发生和发展〔5〕。本文观察分析LncRNA p21是否可通过介导Wnt/β-catenin信号通路而影响胃癌MGC-803的增殖和侵袭。

1 材料和方法

1.1材料 RPMI1640购自Invitrogen公司；裸鼠购自北京实验动物有限公司；胎牛血清、多聚甲醛、链霉素、β-actin抗体、基底膜、Transwell小室均选自Corning公司；涂层基质、TritonX-100和兔抗β-catenin购自CST公司；CCK-8试剂和RIPA裂解缓冲液购自北京索莱宝。

1.2细胞培养 人胃癌细胞MGC-803放于10%胎牛血清中培养后置于37℃培养箱中；细胞均以单层形式生长，细胞达到90%汇合率后再行传代；丢弃培养基，并使用磷酸盐缓冲液(PBS)进行冲洗2次，使用胰蛋白酶0.25%进行消化；细胞间隙增大时，吸弃胰蛋白酶并加入新培养基，制备单细胞悬液。

1.3转染细胞 过表达LncRNA p21采用慢病毒转染方式进行重组质粒和对照质粒，并转入MGC-803中；采用定量PCR扩增检测筛选出的LncRNA p21在胃癌细胞中的过表达情况。

1.4Transwell 应用Transwell试验分析法对Transwell迁移和细胞侵袭进行检测，使用细胞无血清培养基制备1×106细胞/ml的细胞悬液，同时取100 μl接种于Transwell小室上膜，下膜同时加入600 μl含10%血清培养基，细胞穿模24 h，取出小室并涂擦小室上膜细胞，小室下膜细胞采用结晶紫染色1.0%，并使用显微镜拍照，选取5个随机视野计数。

1.5MGC-803细胞形态学检测方法 将胃癌细胞置于含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 g/ml链霉素的DMEM培养液中，37℃，5%Co，饱和湿度条件下培养,胰蛋白醇消化，常规换液传代收集对数生长期细胞，制成1×106/ml的单细胞悬液，设对照组和实验红，对照组加入维拉帕米.两组分别加入终浓度为5 g/ml的Hoechst33342,37℃水浴90 min,商心齐上清，PBS冲洗，重悬于含2%胎牛血清的培养基中.检测前10 min加入FI至终浓度1×106μmol/L，去除死细胞，用FACS流式细胞仪分选细炮细胞，接种于细胞培养液中培养2 w，达到再次分析的细胞数口后收集细胞做Hoechst33342染色计算细胞比例。

1.6CCK-8和体外成瘤 细胞增殖使用CCK-8进行检测；5×103个细胞接种至96孔板，并依据制定实验处理细胞，当细胞达到处理终点时，将旧培养基去除；每孔再次加入100 μl新培养基，并同时将10 μl CCK-8试剂，置于37℃培养箱中孵育2 h；孵育结束后取96孔板放于多功能酶标仪中再450 mm波长处检测其OD吸光度值。将含有对照质粒MGC-803细胞和1×107个稳定过表达LncRNA p21的MGC-803细胞注入裸鼠腋下皮下组织中，并定期测量裸鼠移植瘤体积的变化，饲养30 d后取出瘤体组织进行测量重量。

1.7免疫荧光和蛋白质印迹法 使用4%多聚甲醛对实验处理细胞固定30 min后，采用0.5%的Triton X-100通透1 min，并放于5%驴血清温室下封闭细胞30 min；使用兔抗β-catenin(1∶500稀释)抗体孵育过夜，第2天采用PBS冲洗3次后采用抗兔二抗于温室下孵育1 h，洗净后采用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行封片，并使用共焦显微镜进行拍照。使用RIPA裂解缓冲液提取实验指定细胞内总蛋白；蛋白定量后提取样品20 μg蛋白，经高温变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离；将分离蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，并采用脱脂奶粉5%封闭PVDF膜30 min，再次采用β-catenin(1∶2 000稀释)抗体孵育至第2天后使用TBST洗膜后进行孵育二抗1 h并再次行TBST冲洗，使用定性半定量分析(IPP)和化学发光显色成像。

1.8统计学方法 应用Graphpad Prism7.0软件进行方差分析后行单因素方差分析或非配对t检验。

2 结 果

2.1过表达LncRNA p21对胃癌MGC-803细胞形态学的影响 与Control组比较，LncRNA p21-OE组MGC-803细胞星状形态或纺锤改变为较圆低侵袭状态。见图1。

2.2过表达LncRNA p21对胃癌MGC-803细胞侵袭和迁移的影响 与Control组比较，LncRNA p21-OE组MGC-803细胞迁移、侵袭能力明显降低(P<0.05)。见图2、表1。

图1 过表达LncRNA p21改变MGC-803 细胞形态学特征(×400)

图2 过表达LncRNA p21对MGC-803细胞迁移和 侵袭的影响(结晶紫染色，×200)

表1 过表达LncRNA p21对MGC-803细胞侵袭和 迁移的影响个,n=3)

2.3过表达LncRNA p21对体内外胃癌细胞抑制的作用 与Control组比较，LncRNA p21-OE组3 d、4 d细胞增殖差异有统计学意义(P<0.05)。与Control组比较，LncRNA p21-OE组10 d、20 d、30 d明显抑制移植瘤体积(P<0.05)。见表2、图3。

表2 过表达LncRNA p21对体内外胃癌细胞抑制的作用

图3 移植瘤体积

2.4过表达LncRNA p21对Wnt/β-catenin信号通路活性的抑制 免疫荧光染色显示，与Control组比较，LncRNA p21-OE组显著抑制β-catenin在MGC-803细胞中蓄积(P<0.05)。Western 印迹表明，与Control组比较，LncRNA p21-OE组β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图4、图5、表3。

图4 过表达LncRNA p21抑制β-catenin在MGC-803细胞中蓄积(免疫荧光染色，×400)

图5 过表达LncRNA p21抑制β-catenin蛋白表达

表3 过表达LncRNA p21对Wnt/β-catenin信号通路 活性抑制的情况

2.5Wnt/β-catenin信号通路介导LncRNA p21对MGC-803细胞增殖、侵袭、迁移抑制作用 蛋白质印迹法检测发现LiC1可有效激活LncRNA p21过表达MGC-803细胞Wnt/β-catenin信号通路，且β-catenin表达量显著升高(P<0.05)；CCK-8实验表明LiC1可有效增强LncRNA p21过表达MGC-803细胞的增殖(P<0.05)，且Transwell实验发现LiC1处理LncRNA p21过表达的MGC-803细胞迁移和侵袭有明显增强(P<0.05)。见图6、图7、表4。

图6 β-catenin蛋白表达

图7 Vehicle组和LiCl组侵袭、迁移能力 比较(结晶紫染色，×400)

表4 Vehicle组和LiCl组β-catenin蛋白及细胞增殖、迁移、侵袭能力比较

3 讨 论

胃癌在临床中属于常见恶性肿瘤，早期确诊治愈率较高，但晚期者5年生存率仅为20%〔5〕。虽早期确诊后治愈率较高但部分患者因耽误病情导致胃癌死亡率每年呈显著性升高，目前临床中急需新生物标志和治疗手段以此提高胃癌治愈率〔6，7〕。有研究发现LncRNA直接参与了肿瘤信号调节。LncRNA p21经临床实验证实其在多种肿瘤中均有明显抗癌能力，且LncRNA p21还可有效激活肝细胞癌症和抑制肝细胞增殖等，可明显降低患者对索拉菲尼的耐药性〔8，9〕。前列腺癌中过表达LncRNA p21可直接诱导p53介导细胞凋亡〔10，11〕。本实验发现LncRNA p21过表达经体外实验显示，此标志物可直接抑制MGC-803细胞的侵袭、迁移和增殖，且LncRNA p21在裸鼠成瘤组织中存在明显抑制胃癌肿瘤的生长作用。

Wnt蛋白属于分泌棕榈酰化肽和糖基化，此蛋白可起到调节细胞形态完整、分裂和迁移，且Wnt/β-catenin信号通路异常激活在癌症中起到重要调节作用〔12，13〕。研究发现LncRNA p21过表达可抑制Wnt/β-catenin信号活性，但Wnt/β-catenin信号可激动LiC1激活LncRNA p21过表达胃癌MGC-803细胞对Wnt/β-catenin信号活性，并促进LncRNA p21过表达对MGC-803细胞的增殖和迁移抑制。

综上，Wnt/β-catenin信号传导直接参与了胃癌进展，但LncRNA p21可起到抑制Wnt/β-catenin信号转导的发挥，从而抑制MGC-803细胞的侵袭、迁移和增殖。