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miR-1290靶向STK17A对宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

2022-10-09李园园王英红

中国老年学杂志 2022年19期
关键词:荧光素酶试剂盒引物

李园园 王英红

(石河子大学医学院第一附属医院妇科,新疆 石河子 832000)

宫颈癌是在世界范围内女性最常见的癌症之一,也是造成女性肿瘤死亡的主要原因,在大于500 000例宫颈癌患者中,有80%都是在发展中国家,对女性健康造成严重威胁〔1,2〕。导致宫颈癌发生的因素包括病毒感染、遗传因素和环境因素等,目前,手术切除是治疗早期宫颈癌的主要手段,放化疗也是治疗宫颈癌的一种先进方法〔3〕。虽然宫颈癌的诊断和治疗策略在不断发展和进步,但是患者的生存率仍然较低〔4〕。因此,研究宫颈癌发生和发展新的潜在生物学机制是开发创新且有效治疗方案的关键。微小RNA(miRNA)可通过诱导mRNA分裂和抑制翻译来介导基因的表达,是肿瘤发生的重要影响因素〔5〕。其中miR-411、miR-198、miR-216、miR-137等已报道与宫颈癌细胞的生物过程密切相关〔6~9〕。miR-1290可通过抑制人LIM同源异性域(LHX)6 mRNA表达促进胶质瘤细胞的增殖和转移〔10〕。miR-1290通过靶向肌醇多磷酸-4-磷酸酶B(INPP4B)促进结直肠癌细胞增殖,并在mRNA水平上降低p27表达〔11〕。miR-1290通过靶向细胞因子信号通路(SOCS)4促进肺腺癌细胞的增殖和侵袭〔12〕。因此推测miR-1290可能有原癌基因作用,但miR-1290对于宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响尚未有研究。本研究通过体外细胞实验,探讨抑制miR-1290对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验细胞 人宫颈癌细胞株HeLa(货号:TCHu 20)、SiHa(货号:TCHu 113)和CaSki(货号:TCHu 137)均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库;人宫颈上皮永生化细胞H8(货号:C0397)购自上海冠导生物工程有限公司。

1.1.2主要试剂 含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基购自美国Giboc公司;二甲基亚砜(DMSO)和四甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自美国Sigma公司;Transwell小室购自北京明阳科华生物科技有限公司;Lipofectamine2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司;RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;逆转录试剂盒购自美国Genecopoeia公司;双荧光素酶检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司;野生型和突变型STK17A 3′UTR荧光素酶报告基因载体(STK17A WT、STK17A MUT)由上海生工生物有限公司构建;miR-1290阴性对照(miR-1290 NC)、miR-1290抑制剂(miR-1290 inhibitor)、miR-1290模拟物(miR-1290 mimics)及miR-1290、丝氨酸苏氨酸激酶(STK)17A、β-actin引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3实验仪器 酶标仪Fax-20100购自美国INStat公司;尼康SMZ745光学显微镜购自上海普赫生物科技有限公司;FACSCanto流式细胞仪购自美国Beckman公司;TL988实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)仪购自西安天隆科技有限公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR检测宫颈癌细胞及正常宫颈细胞miR-1290和STK17A表达 将SiHa、HeLa、CaSki、H8细胞接种于含10%FBS的DMEM/F12培养基,置于37℃、5%的细胞培养箱中。当细胞融合80%以上时,胰蛋白酶消化传代,取对数期生长状态良好的细胞,使用RNA提取试剂盒提取总RNA,用逆转录试剂盒反转录成cDNA,以cDNA为模板,进行PCR扩增。miR-1290基因上、下游引物分别为5′-ACACTCCAGCTGGGTGGATTTTTGG-3′和5′-CTCAA CTGGTGTCGTGGA-3′;STK17A基因上、下游引物分别为:5′-GAACACCATGATCCCTTTGG-3′和5′-GTGCCTTTTCCATCCTGAAA-3′;内参基因β-actin的上、下游引物分别为5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′和5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。反应体系为2×SYBR mix 10 μl,H2O 8 μl,上下游引物各0.5 μl,10×cDNA模板1 μl。反应条件设定为:95 ℃预变性5 min、95 ℃变性10 s、60℃退火30 s、40个循环、72 ℃延伸10 min。以β-actin作为内参基因根据2-ΔΔCt算法进行mRNA表达量的计算与分析。取miR-1290相对表达量最高的宫颈癌细胞进行后续实验。

1.2.2细胞转染及分组 将Hela癌细胞接种于含10% FBS的DMEM/F12培养基,置于37℃、5%细胞培养箱中。当细胞融合达80%以上时,胰蛋白酶消化传代,取对数期生长状态良好的细胞,将细胞以1×106个/ml密度传代培养于96孔板中,24 h后取出细胞,根据转试剂盒说明书用Lipfectamine 2000将miR-1290 NC和miR-1290 inhibitor分别转染入HeLa细胞。将细胞随机分为3组:Control组(HeLa细胞未转染)、miR-1290 NC组(HeLa细胞转染miR-1290 NC)、miR-1290 inhibitor组(HeLa细胞转染miR-1290 inhibitor),转染或培养48 h后,用于后续实验。

1.2.3MTT比色法检测细胞增殖率 收集上述1.2.2分组并培养或转染48 h后的细胞,每组设置6个复孔,每孔加入10 μl MTT继续孵育4 h,吸取上清,加入150 μl DMSO,充分震荡混匀15 min后用酶标仪检测各孔570 nm处OD值。细胞增殖率(%)=(实验组OD570 nm-空白组OD570 nm)/(对照组OD570 nm-空白组OD570 nm)。

1.2.4检测细胞迁移和侵袭数 迁移实验:收集上述1.2.2分组并培养或转染48 h后的细胞,胰蛋白酶消化,用无血清DMEM/F12培养基吹打成单细胞悬液。将Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜用磷酸盐缓冲液(PBS)提前润湿5 min,上室加入5×104个细胞,下室加入含10%FBS的DMEM/F12培养基,然后将Transwell小室置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养6 h,取出聚碳酸酯微孔膜,用中性甲醛固定10 min,结晶紫染色20 min后,显微镜下观察。随机选取5个100倍不重叠视野,计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数表示细胞迁移能力。实验重复3次。侵袭实验:实验前2 h将Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜用基底胶包被,其余步骤同迁移实验。

1.2.5双荧光素酶报告基因实验 采用TargetScan在线网站(http://www.targetscan.org/vert_72/)对miR-1290作用的靶基因进行预测,筛选STK17A作为其可能的靶分子。取对数生长期的HeLa细胞接种于96孔板,常规培养24 h后,将细胞分为miR-1290 mimics+STK17A WT组、miR-1290 NC+STK17A WT组、miR-1290 mimics+STK17A MUT组和miR-1290 NC+STK17A MUT组,每组设3个复孔,进行细胞共转染。转染48 h后,应用双荧光素酶检测试剂盒检测STK17A的荧光强度,具体操作按照试剂盒说明书进行,验证miR-1290与STK17A的靶向关系。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1宫颈癌细胞与正常宫颈细胞miR-1290和STK17A表达比较 宫颈癌细胞SiHa、HeLa、CaSi的miR-1290表达量显著高于人正常宫颈上皮细胞H8,STK17A表达量显著低于人正常宫颈上皮细胞H8(均P<0.05),且STK17A均得到表达的宫颈癌细胞中以HeLa的miR-1290相对表达量最高。见表1。所以,选择HeLa细胞进行后续实验。

2.2抑制miR-1290对HeLa细胞STK17A表达的影响 与Control组(0.15±0.11)和miR-1290 NC组(0.23±0.17)相比,miR-1290 inhibitor组HeLa细胞STK17A mRNA表达水平(10.27±0.96)显著升高(P<0.05)。

2.3抑制miR-1290对HeLa细胞增殖的影响 与Control组〔(27.35±1.12)%〕和miR-1290 NC组〔(29.77±1.01)%〕相比,miR-1290 inhibitor组〔(10.53±1.28)%〕HeLa细胞增殖率显著降低(P<0.05)。

2.4抑制miR-1290对HeLa细胞迁移和侵袭的影响 与Control组和miR-1290 NC组相比,miR-1290 inhibitor组HeLa细胞迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 miR-1290对HeLa细胞迁移和侵袭的 影响个,n=3)

2.5miR-1290与STK17A的靶向关系的预测与验证 生物信息学预测结果显示,miR-1290序列上存在STK17A连续的结合位点。见图1。与miR-1290 NC+STK17A WT组(1.03±0.12)相比,miR-1290 mimics+STK17A WT组(0.47±0.06)STK17A报告基因的荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而miR-1290 mimics+STK17A MUT组(0.96±0.09)和miR-1290 NC+STK17A MUT组(0.98±0.10)STK17A报告基因的荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。

图1 生物信息学预测miR-1290与 STK17A 3′ UTR结合位点

3 讨 论

宫颈癌是女性生殖系统中较为常见的肿瘤,恶性程度极高。癌细胞的迁移和侵袭是导致患者病情恶化,甚至死亡的重要原因〔13〕,miRNAs的异常表达与宫颈癌的发生发展密切相关,miRNAs可通过调控其对应的靶基因表达水平影响癌细胞的生物过程。

miRNA是由长度为18~26个核苷酸构成的内源性非编码单链小分子RNA,不具备编码蛋白质的功能,但其表达异常可引起肿瘤等多种疾病的产生〔14〕。miRNA对于宫颈癌的治疗和预后都有重大意义,可能参与宫颈癌发生发展的全过程,调节癌细胞的增殖、侵袭、转移和凋亡。Huang等〔15〕研究发现miR-1290在胃癌患者的细胞系中过表达,可加强胃癌细胞的增殖和侵袭能力,Jin等〔16〕研究发现上调非小细胞肺癌中miR-1290表达可增强细胞增殖、集落形成和侵袭能力。本研究结果提示抑制miR-1290可能抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

miRNA可作为宫颈癌早期诊断和治疗的靶标,有创伤小、易获取和可重复等优点。Liu等〔17〕研究发现miR-1290在结直肠癌和胰腺癌组织中表达异常,可作为结直肠癌和胰腺癌早期诊断的生物标志物。本研究结果提示miR-1290和STK17A之间可能存在靶向关系。STK17A是凋亡相关蛋白(DAP)激酶的家族成员,编码有蛋白激酶结构的自磷酸化核蛋白,有诱导细胞凋亡的作用,在肿瘤细胞中表达较低〔18〕。作为一种凋亡相关因子,紫外线或某些药物的刺激可通过STK17A高表达引起细胞凋亡,Xu等〔19〕研究表明过表达STK17A可促进人乳腺癌细胞的凋亡,Gao等〔20〕研究表明卵巢癌细胞中STK17A表达水平的改变导致癌细胞对卡铂和紫杉醇的易感性发生变化。而miRNA主要通过与靶基因3′ UTR结合而调控细胞生物学功能,为了进一步验证miR-1290与STK17A的靶向关系,本研究结果提示miR-1290可能通过靶向STK17A进而抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

综上,miR-1290能通过靶向调控STK17A抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移,为宫颈癌的治疗提供又一新的靶标,但是STK17A在各种类型的肿瘤细胞表达及其对肿瘤发生和转移的作用机制较为复杂,尚需进一步研究。

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