AMPK信号通路在中老年肺癌患者恶性质胸腔积液中表达及临床意义

文荣 王翠峰 张智燕 任美英

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院检验科，内蒙古 包头 014010)

通常在正常人体肺脏层胸膜和壁层胸膜之间有5～15 ml液体，在呼吸运动中起润滑作用，当循环障碍、炎症刺激，尤其肿瘤转移时胸膜腔就可形成大量液体，导致胸腔积液的发生。临床诊断胸腔积液的方法中，辅助检查以实验室检查最为常见，其检查项目包括胸腹水的脱落细胞学检查、免疫组化病理学检查，但目前仍无十分明确的诊断方法，故存在一定假阴性率〔1,2〕，因此探寻敏感性和高特异度的早期诊断方法就显得尤为重要。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路作为细胞能量感受器，任一环节出现问题都会导致肿瘤的发生发展〔3〕，肝激酶(LK)B1是AMPK的上游激酶，它对细胞的有效调控是其抑制肿瘤发生发展的重要原因；LKB1-AMPK负向调控某些重要的信号通路，如哺乳动物雷帕霉素蛋白等。本研究探明AMPK信号通路对中老年肿瘤患者胸腔积液表达的影响。

1 材料与方法

1.1研究对象 2017～2019年包头医学院第一附属医院呼吸科及胸外科门诊及住院病人，具有完整的病例资料中老年肺癌患者的胸腔积液标本120例，均为未接受任何治疗前采集的胸水。结合临床资料从中筛选出恶性胸腔积液78例，良性胸腔积液42例，所有病例经组织活检及细胞学检查确证。其中男85例，女35例，年龄50～71〔平均(58.5±13.1)〕岁，所有患者签署知情同意书。

1.2实验试剂 细胞染液试剂盒：购自南京三生生物公司；实时荧光定量RT-PCR试剂盒(购自天津生物芯片技术有限责任公司；引物：由Invitrogen赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成；蛋白印迹抗体：LKB1、AMPKα1、AMPKα2、p-AMPK抗体均购自Invitrogen赛默飞世尔科技(中国)有限公司，二抗购自美国CST公司。

1.3标本处理 分别收集良、恶性胸腔积液标本80 ml，分装于不同离心管中并做标识，以2 000 r/min离心10 min，留取细胞沉淀。分别于4℃冰箱和-80℃冰箱保存，用于脱落细胞学检查、RT-PCR及Western印迹实验。

1.4脱落细胞学检查 将良、恶性胸腔积液分组后离心留取沉淀，制作细胞涂片，用瑞吉(瑞氏-吉姆萨)染色法进行细胞染色。由高年资细胞组专家在倒置显微镜下观察细胞形态并做出良、恶性胸腔积液的判断。

1.5判断依据 (1)良性胸腔积液：颜色多为淡黄色或乳白色，主要以白细胞、吞噬细胞等非上皮细胞为主，偶见间皮细胞小团，其形态呈圆形或卵圆形。(2)恶性胸腔积液：颜色大部分以血性或洗肉水色多见，肿瘤细胞形态畸形，核质比增大，染色深，可见乳头状、桑葚状排列，见图1。

1.6实时荧光定量PCR检测基因表达 从-80℃冰箱取出良恶性组胸腔积液标本，待充分融化后以3 500 r/min离心10 min，弃去上清，留取下层细胞沉淀。用Trizol提取液提取各组胸水总RNA，并计算RNA 浓度，应用RT-PCR将其反转录成cDNA。反应条件第一步:50℃ 2 min；第二步：97℃ 2 min；第三步:96℃ 10 s，60℃ 30 s，75℃ 30 s；第四步：70℃ 2 min,共35个循环，实验重复3次。引物序列如下：AMPKα1：上游：5′-CAGCTTGCAGTGGCTTATCA-3′，上游：5′-CAGTTCATCCAATGGACATC-3′；AMPKα2：上游5′-CGCTGTCATCGCTTTATCG-3′，下游：5′-ATGCTCAGACACCTCCACC-3′；LKB1上游：5′-TGGTTCCGGAAGGAACATCCC-3′，下游：5′-CACCGTGAAGTCCTGAGTGTAG-3′；β-actin上游：5′-TC-CCTGAAGAAGAGCTACGA-3′，下游：5′-AGCACTGTGGTGGCGTACAG-3′。

图1 倒置显微镜下细胞形态学(×20)

1.7Western印迹方法检测蛋白水平表达 将良恶性胸腔积液标本分组后分别取80 μl放入EP管中并做好标记。用蛋白裂解液裂解两组细胞，提取总蛋白。轻取蛋白样品95C°至完全变性，再进行10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳、转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5% 牛血清白蛋白的TBST室温封闭1 h。之后将PVDF膜分别与AMPKα1(1∶1 000)、AMPKα2(1∶1 000)、p-AMPK(1∶2 000)、LKB1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗体4℃孵育过夜。待一抗孵育结束后，室温摇床上用TBST洗膜3次，每次10 min。加入稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(1∶4 000)37℃室温孵育2 h，用电化学发光(ECL)法显影，曝光5～10 min。后用Image J软件分析两组蛋白条带的灰度值，与内参灰度值比值即为该蛋白含量。

1.8统计学分析 采用GraphPad Prism7.0软件进行t检验。所有Real-time数据mRNA相对值以ΔΔCt值表示：ΔΔCt=2-ΔΔCt。

2 结 果

良、恶性胸腔积液组LKB1 AMPKα1、AMPKα2 mRNA相对表达量、LKB1、p-AMPK蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05，P<0.001)，见表1，图2。

表1 良恶性胸腔积液LKB1、AMPKα1、AMPKα2蛋白和mRNA及p-AMPK蛋白表达

图2 良恶性胸腔积液中LKB1、AMPKα1、AMPKα和 p-AMPK蛋白表达

3 讨 论

肺癌对人类健康和生命存在极大危害，发生机制较为复杂。胸腔积液是常见的临床症状，对其类型的明确诊断对于临床病情评估和对症治疗尤为重要。AMPK信号传导通路被称之为“细胞能量感受器”〔4〕，可感受腺苷-磷酸/腺苷三磷酸(AmP/ATP)的比值的变化。LKB1作为AMPK的上游基因可直接激活AMPK，被激活的AMPK正向调节结节性硬化复合体基因(TSC)，增加TSC1/2复合物表达水平，使mTOR负向调节〔5,6〕。本研究结果表明，AMPK信号通路在老年患者良、恶性胸腔积液中均有表达。本研究结果与该信号通路对原发肿瘤细胞〔7〕代谢的调节相一致。本研究结果也和Matsumto等〔8〕在NSCLC中表明的基因突变研究相一致；另外，在鼠模型研究中，Contreras等〔9,10〕也有相同的结果，本研究结果恶性胸水LKB1蛋白表达的降低可能与之有关；与良性胸水比较，AMPKa与p-AMPKα蛋白表达在恶性胸水中仅有部分样本有趋势性改变，这可能与恶性积液中存在某些干扰肿瘤细胞代谢相关的因子有关；王丽红等〔11〕对子宫内膜癌发病机制中的研究证实，在增殖阶段子宫内膜、内膜样腺癌、内膜非典型增生组织内，AMPK与LKB1表现出较低表达水平，在这两种基因表达水平而言，相比正常子宫内膜组，子宫内膜样腺癌组则显著较低。说明在子宫内膜出现非典型增生与此增生不断进行最终癌变这一环节， AMPK信号传导通路的异常发挥起到关键作用。目前有关AMPK信号传导通路在子宫内膜癌、肺小细胞肺癌及喉鳞状细胞癌等中的研究表明:LKB1与AMPK表达均表现为下降趋势，这与本研究结果肺腺癌性胸腔积液中的AMPK信号传导通路变化趋势相一致。

本研究结果与许晶等〔12〕AMPK信号通路对原发肿瘤细胞代谢调节结果的变化趋势相一致，虽然该信号通路在相关研究中取得了一些进展和成果，但尚未完全阐明关键机制，因此仍需做进一步实验研究为肿瘤诊断及治疗开辟一条新的途径。