败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及机制研究

叶艺兰,王志红,刘建祥,王剑梅

(1.韶关学院医学院临床医学系 内科,广东 韶关512000;2.粤北人民医院 神经内科;3.韶关学院医学院附属医院 内科)

我国每年胃癌发病人数约占世界发病总数的42%，严重威胁我国居民生命健康[1]。近年来，越来越多的学者开始关注中草药对胃癌治疗的应用[2]。败酱草在抗肠癌[3]、宫颈癌[4]、肝癌[5]、胃癌[6]等多种癌症中均有报道，但其在抗肿瘤方面的具体作用机制尚不明确。本文通过分析败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞增殖和细胞周期的影响，旨在为败酱草有效成分用于治疗胃癌提供理论根据。

1 材料与方法

1.1 材料人胃癌SGC-7901细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。SPF级别雄性SD大鼠36只，体质量200-230 g，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 试剂与仪器(1)败酱草总皂苷购买自成都瑞芬思生物科技有限公司；(2)酶标仪购自Bio-Rad公司，流式细胞仪购买于Thermo Fisher，凝胶成像仪购买于Bio-Rad，澳洲胎牛血清购买于Thermo Fisher，CCK8试剂盒购买于日本同仁，细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、细胞周期蛋白E(CyclinE)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、自噬核心蛋白(Beclin-1)等抗体购买于北京博奥森生物技术有限公司，脱脂奶粉购买于伊利公司，PBS、胰酶等购买于Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1败酱草总皂苷含药血清制备 将大鼠随机分为对照组、败酱草总皂苷低、中、高浓度组，每组9只，败酱草总皂苷组参考文献[7]予以50、100、150 mg/kg败酱草总皂苷灌胃，对照组予以等体积生理盐水灌胃，1次/d，连续7 d。末次给药2 h后，麻醉大鼠取血，分离血清，使用0.22 μm滤膜过滤分装。

1.3.2人胃癌SGC-7901细胞培养 人胃癌SGC-7901细胞置于10%澳洲胎牛血清培养基中培养，至细胞生长80%左右进行传代培养，备用。

1.3.3MTT检测败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞生长的影响 (1)收集对数生长期SGC-7901细胞用0.1%胰酶消化，用澳洲胎牛血清稀释成浓度为5×(103-104个/ml)的单细胞悬浮液；(2)接种于96孔板中，每孔加入200 μl，分为对照组和药物组(包括低浓度组、中浓度组和高浓度组)，对照组不加药物，只加细胞，药物组拟加入败酱草总皂苷含药血清，每组各设置3孔，继续培养至细胞贴壁；(3)接种后培养24 h，败酱草总皂苷组分别加入200 μl不同浓度含药血清，对照组加入200 μl含有10%澳洲胎牛血清的RPMI1640培养液；(4)继续培养48 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，每孔加入DMSO液150 μl，10 min后使用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值，重复三次，计算细胞生长抑制率，并根据细胞生长抑制率及含药血清浓度制作曲线，计算IC50值。

1.3.4CCK8法检测败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响 细胞培养和处理同1.3.3，继续培养24、48、72 h时，每孔加入189 μl的CCK8试剂盒试剂，在37℃培养箱中孵育20 min，使用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值，重复三次，结果取平均值。

1.3.5流式细胞术检测败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞周期的影响 (1)收集各组细胞样品，制成单细胞悬浮液，将细胞悬浮液移至1.5 ml离心管中；(2)1 000 r/min离心5 min，PBS清洗，预留0.5 ml PBS，加入1 ml预冷70%乙醇，4℃固定过夜；(3)轻轻刮动离心管混匀细胞，加入5 μl核糖核酸酶A，37℃静置1 h，加入50 μl浓度为100 μg/ml的PI，室温避光染色30 min；(4)利用流式细胞仪检测细胞周期时相，分析细胞DNA含量，计算G1期、G2期以及S期细胞比例。

1.3.6Western blot技术检测细胞周期相关蛋白表达 (1)收集各组细胞样品，提取总蛋白，保存于4℃冰箱备用；(2)SDS-PAGE凝胶进行蛋白上样电泳，转膜、封闭、抗体孵育；(3)以1∶1比例混匀超敏发光液A、B，滴加至PVDF膜上，使用Bio-Rad凝胶成像仪采集信号、拍照，运用ImageJ图像分析软件分析CyclinD1、CyclinE、CDK4、Beclin-1灰度值。

2 结果

2.1 败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞生长的影响

MTT检测结果显示，败酱草总皂苷含药血清IC50值为119.72 μg/ml，且不同浓度败酱草总皂苷对人胃癌SGC-7901细胞生长均具有抑制作用，抑制率随血清浓度升高而增大。见表1。

表1 败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞生长的影响

2.2 败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

药物组培养24、48、72 h的OD值均低于对照组(P<0.05)，OD值高浓度组<中浓度组<低浓度组(P<0.05)。见表2。

表2 败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

2.3 败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞周期的影响

与对照组比较，药物组细胞G1期细胞百分比明显升高(P<0.05)，G2期、S期细胞百分比明显降低(P<0.05)，细胞百分比随着血清浓度升高、降低而增加、减少(P<0.05)。见图1，表3。

图1 败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞周期的影响

表3 败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞周期的影响

2.4 败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞周期相关蛋白表达水平的影响

与对照组比较，药物组细胞周期相关蛋白CyclinD1、CyclinE、CDK4蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，高浓度组<中浓度组<低浓度组；Beclin-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，高浓度组>中浓度组>低浓度组。见表4，图2。

表4 败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞周期相关蛋白表达水平的影响

图2 败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞周期

3 讨论

胃癌是一种全球高发的恶性肿瘤疾病，患者五年生存率低于25%，手术治疗效果不佳且传统放化疗副作用大，患者生存质量差，随着恶性肿瘤治疗进入分子靶向时代，中医的辨证论治在当代精准医学治疗中也有了新应用[8]。中医所谓热毒内蕴与胃癌的发生有密不可分的关系[9]。因此胃癌的主要病机特点为正虚为本，湿毒瘀滞胃脘为标，故在胃癌的治疗上，主要以化湿解毒为主[10]。败酱草最早记载于《神农本草经》，其全草入药，可与其他中药药方配伍用于治疗多种肿瘤疾病[11]。研究显示，百花败酱草有效部位对人子宫鳞癌细胞有明确抑制作用，与其作用浓度及作用时间有关[12]。研究还显示，败酱草总皂苷能够抑制U14宫颈癌小鼠生长，并通过提高免疫功能以及抗氧化能力发挥抗肿瘤作用[13]。丁芮等[14]报道表明，败酱草可降低大肠癌5-FU耐药细胞株细胞活力，且败酱草浓度越高，细胞活力越低。

本文研究结果显示，败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞增殖有明显抑制作用，随着药物浓度升高，抑制作用越强[12,14]。细胞无限增殖是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一，细胞增殖又主要通过细胞周期实现[15]。细胞周期调节既能够影响细胞分裂，还能够影响细胞凋亡，而凋亡相关信号通路在细胞死亡前又可诱发细胞周期阻滞，故细胞周期调控失常是肿瘤细胞发生、发展的重要因素[16]。G1期和S期是细胞周期调控的重要节点，受到细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶等蛋白调控[17]。CyclinD1、CyclinE、CDK4是细胞由G1期进入S期的关键蛋白，Beclin-1蛋白可与CyclinD选择性结合，阻止细胞从G1期进入S期，从而抑制细胞增殖[18-19]。本文研究结果显示，药物组细胞G1期细胞百分比明显升高，高浓度组>中浓度组>低浓度组；G2期、S期细胞百分比明显降低，高浓度组<中浓度组<低浓度组，表明败酱草总皂苷含药血清可使人胃癌SGC-7901细胞阻滞于G1期，有效抑制细胞进入细胞周期，诱导胃癌细胞周期阻滞，进而促进细胞凋亡。本文研究结果还显示，细胞周期相关蛋白CyclinD1、CyclinE、CDK4蛋白表达水平高浓度组<中浓度组<低浓度组<对照组，Beclin-1蛋白表达水平高浓度组>中浓度组>低浓度组>对照组，表明败酱草总皂苷含药血清下调了CyclinD1、CyclinE、CDK4蛋白表达，上调了Beclin-1蛋白表达，并且与血清浓度呈依赖关系。因此，败酱草总皂苷含药血清对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制机制可能与影响细胞周期及其相关蛋白水平相关。

综上所述，败酱草总皂苷含药血清可能起到抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖的作用，其机制可能与干预细胞周期，影响细胞周期相关蛋白表达有关，通过阻断细胞周期，抑制肿瘤细胞增殖，最终发挥抗癌作用。