生物合成的MCT4 siRNA抑制卵巢癌细胞的增殖作用

张 莹,赵 婷，马 静

(解放军总医院第二医学中心 国家老年疾病临床医学研究中心,北京100853)

单羧酸转运蛋白(MCT)是溶质载体16(SLC16)家族成员，对于短链单羧酸盐、激素、营养素和氨基酸的运输至关重要。MCT家族共有16个成员，分别是MCT1-14和2个钠离子依赖的MCT成员SMCTs 1/2,SLC5A8/12。MCT 1-4 是质子依赖的转运蛋白，对于糖酵解产物(如乳酸和丙酮酸)以及酮体(如乙酰乙酸和β-羟基丁酸)的跨膜运输发挥关键作用[1]。生理条件下MCT1-4协同形成乳酸穿梭系统，维持糖酵解细胞和氧化细胞之间的乳酸稳态。从糖酵解细胞输出的乳酸被氧化细胞吸收用于有氧代谢，例如骨骼肌中的白色糖酵解细胞和红色氧化细胞之间以及大脑中的星形胶质细胞和神经元之间的乳酸稳态[2]。研究表明MCT1/2/4参与肿瘤的代谢过程[3]，糖酵解(glycolytic)型癌细胞依靠糖酵解来适应低氧环境，分解葡萄糖排出乳酸，而氧化型(oxidative)癌细胞则摄取糖酵解癌细胞分泌的乳酸作为能量来源，这是一种“代谢共生”现象，其中MCT1、4发挥最重要的作用[4]。除了直接参与代谢外，乳酸能够作为一种信号分子刺激肿瘤血管内皮细胞的增生[5]，促进肿瘤细胞产生免疫耐受[6]等。

目前针对MCT1已有相应的抑制剂，例如AZD3965、BAY-8002和7ACC2等，其中AZD3965正在进行Ⅰ期临床试验。而MCT4尚无有效的抑制剂，本文利用大肠杆菌生物合成MCT4的siRNA并初步验证了其抑制作用。

1 材料与方法

1.1 利用大肠杆菌表达siRNA

以大肠杆菌tRNA为支架，将MCT4siRNA前体序列插入tRNA的环形序列中，形成带有MCT4前体发卡状siRNA的环状结构，插入原核表达载体中进行表达，表达产物进行HPLC纯化后用于后续研究(图1)。MCT4siRNA序列，Sense:CGAGACAACGUGACUUUAATT,Antisense:UUAAAG-UCACGUUGUCUCGTT。

1.2 细胞培养

人卵巢癌细胞株SKOV3和A2780为本室保存，经STR鉴定正确。细胞在含有10%胎牛血清(GIBCO,NY,USA)和1%的青链霉素(GIBCO,NY,USA)的DMEM培养基(GIBCO,NY,USA)中，在37℃，5%CO2的培养箱中进行培养。siRNA细胞转染采用脂质体转染试剂lipofectamin2000(Invitrogen，CA，USA)。

1.3 RNA分离和实时定量PCR(RT-PCR)

使用总RNA试剂盒提取试剂盒(TaKaRa Bio,Otsu,Japan)从培养细胞中提取总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa Bio,Otsu,Japan)生成互补DNA(cDNA)。定量RT-PCR利用SYBR Green PCR master mix(TaKaRa Bio,Otsu,Japan)在实时定量PCR仪上进行，反应条件为：95℃10min，然后95℃ 30 s，57℃ 1 min，72℃ 1 min循环30次，以GAPDH作为PCR产物定量和标准化的对照。引物序列，MCT4-上游:5’-CAGTTCGAGGTGCTCATGG-3’，MCT4-下游:5’-ATGTAGACGTGGGTCGCATC-3’;GAPDH-上游:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’ GAPDH-下游:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3。

1.4 Western blot

用RIPA裂解缓冲液(白鲨生物，合肥)制备细胞提取物，并在4℃下以13 000×g离心30 min。然后用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质样品并转移到PVDF膜上(Millipore Corporation,MA,USA)。在室温下用5%牛奶封闭1小时后，4℃下用一抗孵育膜过夜。然后与HRP结合的二抗孵育，使用化学发光成像系统进行检测。

1.5 细胞活力测定

将MCT4siRNA转染卵巢癌细胞，在24、48、72及96小时后使用CCK8检测试剂盒(Bimake，TX，USA)对细胞进行活性检测。每个孔中的细胞在37℃下与10 μl CCK8工作溶液孵育2小时。使用Epoch微孔板读取器(BIO-TEK,VT,USA)测量每个孔在450 nm处的吸光度。

1.6 代谢分析

细胞经siRNA处理后，裂解，上清使用葡萄糖分析试剂盒(Biovision,CA，USA)测定葡萄糖摄取量。用乳酸测定试剂盒(Biovision,CA，USA)检测细胞乳酸含量。使用细胞耗氧量检测kit细胞(BD Biosciences,San Jose,CA)的耗氧率，所有操作按照说明书进行。

1.7 统计学方法

所有数据均以平均值±标准值表示，使用GraphPadPrism v8.0软件进行处理。治疗组与对照组之间进行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生物合成的MCT4siRNA制备

将MCT4的siRNA前体插入tRNA骨架后形成tRNA-siRNA结构，命名为Bio-siMCT4 ，设计及生产流程如图1所示。Bio-siMCT4在大肠杆菌合成后经HPLC纯化可以获得高纯度的 siRNA(图2)，产量为1.6 mg/L。

图1 生物合成的MCT4siRNA制备流程

图2 生物合成的MCT4siRNA纯化

2.2 生物合成的MCT4 siRNA能有效抑制MCT4的表达

Bio-siMCT4转染细胞后检测MCT4的表达，RT-PCR和Western blot显示Bio-siMCT4能有效降低 MCT4的核酸和蛋白水平，与化学合成的siRNA相比具有更高的效率(图3)。

图3 Bio-siMCT4对MCT4的抑制作用

2.3 生物合成的MCT4 siRNA抑制卵巢癌细胞的糖酵解及细胞增殖作用

将MCT4siRNA转入卵巢癌细胞中，检测葡萄糖摄取、糖酵解速率、乳酸生成以及细胞耗氧量，以评估卵巢癌细胞的糖酵解及氧化磷酸化水平。结果显示生物及化学合成的MCT4 siRNA均能抑制卵巢癌细胞的糖酵解，促进细胞的氧化磷酸化，但是生物合成的siRNA效果更好(图4)。细胞增殖实验证明生物及化学合成的MCT4 siRNA均能抑制卵巢癌细胞的增殖，生物合成的siRNA效果更好(图5)。

图4 Bio-siMCT4对卵巢癌细胞糖酵解的抑制作用

图5 Bio-siMCT4对卵巢癌细胞增殖的抑制作用

3 讨论

核酸药物是重要的一类生物药物，能够作用于基因、转录本、蛋白质、小分子，特别是对于传统药物难以成药的靶点具有重要的价值。RNA药物种类主要有mRNA、小RNA、反义核酸及RNA适配体等。mRNA疫苗在新型冠状病毒的防疫中发挥了极为重要的作用[7]，其也可以通过编码治疗蛋白抗原用以免疫细胞治疗。小RNA包括siRNA、MiRNA，与反义核酸作用类似，主要用于抑制致病性RNA活性。RNA适配体能够结合蛋白质，发挥调节蛋白活性的作用。Pegaptanib作为结合VEGF的RNA适配体在2004年获批上市用于治疗老年湿性黄斑变性(Neovascular AMD)，是第一个获得FDA批准的核酸药物[8]。此后靶向ApoB100、肌萎缩蛋白dystrophin51外显子、脊髓性肌萎缩致病基因SMN2及TTR基因用于高脂血症(HoFH)、假性肥大型肌营养不良(DMD)、脊髓性肌萎缩症(SMA)及hATTR淀粉样变性的寡核苷酸药物Mipomersen[9]、Eteplirse[10]、Nusinersen[11]和Inotersen[12]获批上市。随着siRNA技术的发展，siRNA药物也得到迅速发展，目前已有三种siRNA药物获得FDA批准，分别是靶向羟基酸氧化酶1(HAO1)治疗原发性高草酸尿症1型(PH1)的Lumasiran[13]，靶向氨基乙酰丙酸合成酶1(ALAS1)用于治疗急性肝卟啉症(AHP)的Givosiran[14]以及靶向TTR基因用于治疗hATTR淀粉样变性的Patisiran[15]。

核酸药物在早期并不为人们所重视，主要原因是RNA药物成本高、容易降解，半衰期短。小RNA及寡核苷酸药物通常是化学合成，通过碱基修饰提高药物的稳定性，利用纳米材料提高其半衰期及靶向性。生物合成的小RNA技术将小RNA前体插入核糖体tRNA支架中，在大肠杆菌表达，由于tRNA在大肠杆菌表达丰度极高，可以高效表达小RNA前体。tRNA-siRNA进入细胞后siRNA前体经切割形成活性RNA从而发挥作用。与化学合成的siRNA相比，生物合成的siRNA成本极低，未经过体外修饰，活性更好，具有良好的应用前景[16]。本实验选择卵巢癌的MCT4作为药物靶点，设计、表达合成了针对该分子的生物合成的siRNA，结果显示Bio-siMCT4能够显著抑制MCT4在卵巢癌细胞中的表达，并显著抑制卵巢癌细胞的糖酵解水平和细胞增殖。与化学合成的siRNA相比，Bio-siMCT4具有更好的活性。实验表明，生物合成的MCT4siRNA对于卵巢癌细胞具有良好的治疗作用，具有新RNA药物的成药潜质。