基于Postn介导的TGF-β/NF-κB通路探讨绿原酸改善心肌肥大的作用及机制研究

卢 娜，金立民，苑 野*

(吉林大学大学第一医院 1.小儿心血管科;2.麻醉科,吉林 长春130021)

心肌肥大(CHT)是心力衰竭和心脏重塑等心脏病的病理表现之一，也是心律失常、心肌梗死和猝死原因之一[1-2]。探究心肌细胞肥大的机制并找到有效干预手段对于防止心肌肥大具有重要意义。然而，心肌肥大发病机制复杂，至今仍未完全阐明。骨膜蛋白(Postn)是心肌肥大的关键因子，现有研究发现Postn的水平与压力超负荷引起的左心室肥厚密切相关，其在心脏重构及心肌纤维化过程中起到了介质的作用[3-4]。更进一步发现，Postn能够诱导整合素α3，α5，β3，β5激活TGF-β/NF-κB核因子信号通路释放ANP、脑钠肽(BNP)和β-MHC等肥大标志物，进而促进心肌肥大[5]。绿原酸(CGA)是由咖啡酸与奎尼酸形成的缩酚酸，属于苯丙素类化合物。CGA具有抗氧化清除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒等生物活性[6-7]。研究发现，CGA在改善心肌肥大方面具有潜在的良好功效[8]。此外前期研究也发现CGA能够显著抑制Postn，然而，Postn介导的TGF-β通路是否参与CGA抑制心肌肥大少见报道[1-2]，鉴于此，本研究旨在借助心肌肥大细胞模型探究CGA通过Postn/TGF-β/NF-κB通路抑制心肌肥大的机制，为心肌肥大的有效治疗和CGA的临床应用提供新的思路和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠心肌细胞系 H9c2(ATCC)，胎牛血清、DMEM 培养基(HyClone 公司)，Postn、α3、α5、β3、β5、TGF-β、NF-κB、ANP、BNP和β-MHC单克隆抗体(Abcam)，绿原酸、AngⅡ(美国 Sigma 公司)，Lipofectamine 2000试剂盒(Thermo Fisher)，山羊抗兔二抗(上海碧云天)，CCK-8 细胞检测试剂盒(上海碧云天)，Postn-siRNA(上海吉玛生物有限公司)，引物(上海生工生物)，细胞凋亡检测试剂盒(四正柏生物)，ELISA试剂盒(杭州联科生物)。倒置显微镜(日本尼康公司)，流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)。凝胶成像分析系统(美国伯乐公司)。

1.2 方法

1.2.1心肌细胞肥大模型构建 胰酶消化 H9c2 心肌细胞后接种于完全培养基，24 h 后换1%胎牛血清培养基同步化，采用1 μmol/L 浓度AngⅡ诱导48 h 后胰酶消化，用于后续实验。

1.2.2分组及干预方法 将细胞分为：(1)对照组:DMEM 完全培养基作为安慰剂；(2)模型组：不做特殊处理；(3)Postn-siRNA组：采用Lipofectamine 2000试剂盒将Postn-siRNA转染至模型细胞；(4)绿原酸组：培养基中加入绿原酸100 μmol /L；(5)Postn-siRNA+绿原酸组：绿原酸100 μmol /L+Postn-siRNA转染。

1.3 观察指标

1.3.1细胞表面积测定 各组细胞以1×104个/cm2密度种植于24孔板，置于Nikon倒置显微镜下采集图像，随机选取5个视野，每个视野选取10个细胞，应用 Image-Pro Plus 图像分析软件检测细胞表面积，取均值。

1.3.2CCK-8 检测细胞活力 于每孔中加入 10%CCK-8 溶液继续培养 1.5 h，用酶标仪检测 450 nm波长下吸光度(OD450)。细胞存活率%=(处理组OD450/对照组OD450)×100%。

1.3.3Western blot检测蛋白表达 RIPA 裂解液裂解蛋白，提取细胞总蛋白，采用BCA法测定总蛋白浓度，SDS-PAGE分离目的蛋白，随后转膜，用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，加入1∶1 000 稀释后一抗(Postn、α3、α5、β3、β5、TGF-β、NF-κB、ANP、BNP和β-MHC)，4℃ 摇床孵育过夜，TBST 洗膜后加入HRP标记二抗(1∶2 000)，室温摇床1 h，以GAPDH 为内参，采用凝胶成像分析系统进行定量。

1.3.4RT-PCR检测mRNA表达 采用Triozol提取细胞总RNA，用分光光度计测定所抽提RNA的浓度和纯度，按照说明书进行cDNA 合成。取反转录产物进行Real-time PCR反应。按以下体系进行Real-time PCR反应:2×qPCR Mix 10 μl，primer 各2 μl，cDNA 2 μl，50×Rox 0.4 μl，加ddH2O至20 μl。反应程序:95℃ 10 s;60℃ 20 s;72℃15 s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用相对定量 2-ΔΔCt计算 Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1 mRNA 相对表达量。

1.3.5流式细胞术检测细胞凋亡 用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，250 μl结合缓冲液重悬细胞，随后加入5 μl Annexin V/FITC，室温避光孵育5 min；再加入10 μl 20 μg/mL的PI溶液，最后加入400 μl PBS，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.4 统计分析

应用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较应用LSD-t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞表面积比较

与对照组比较，模型组细胞表面积明显增大(P<0.05)；与模型组比较，Postn-siRNA组和绿原酸组细胞表面积明显减小(P<0.05) ，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与Postn-siRNA组和绿原酸组相比，Postn-siRNA+绿原酸组表面积明显减小(P<0.05) ，与对照组差异无统计学意义(P>0.05) 。详见图1。

图1 各组细胞表面积比较

2.2 各组细胞活力比较

与对照组比较，模型组细胞活性明显减少(P<0.05);与模型组比较，Postn-siRNA组和绿原酸组细胞活性明显增加(P<0.05)，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与Postn-siRNA组和绿原酸组相比，Postn-siRNA+绿原酸组活性明显增加(P<0.05)，与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2。

图2 各组细胞活力比较

2.3 各组蛋白表达水平比较

与对照组比较，模型组Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1、ANP、BNP和β-MHC蛋白表达明显上调(P<0.05)；与模型组比较，Postn-siRNA组和绿原酸组细胞上述蛋白表达明显下调(P<0.05)，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与Postn-siRNA组和绿原酸组相比，Postn-siRNA+绿原酸组细胞上述蛋白表达明显下调(P<0.05)，与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，详见图3。

图3 各组蛋白表达比较

2.4 各组细胞mRNA相对表达水平比较

与对照组比较，模型组Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1 mRNA相对表达明显上调(P<0.05)；与模型组比较，Postn-siRNA组和绿原酸组细胞上述mRNA表达明显下调(P<0.05)，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与Postn-siRNA组和绿原酸组相比，Postn-siRNA+绿原酸组细胞上述mRNA表达明显下调(P<0.05)，与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，详见图4。

图4 各组细胞mRNA相对表达水平比较

2.5 各组细胞凋亡率比较

与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显增加(P<0.05)，与模型组比较，Postn-siRNA组和绿原酸组细胞凋亡率明显减小(P<0.05)，两组比较差异无统计学意义(P>0.05);与Postn-siRNA组和绿原酸组相比，Postn-siRNA+绿原酸组细胞凋亡率明显减小(P<0.05)；与对照组差异无统计学意义(P>0.05) 。详见图5。

图5 各组细胞凋亡率比较

3 讨论

心肌肥大是心脏对多种心血管刺激出现的一种失代偿性反应，未加干预可进展为心力衰竭等多种疾病，甚至猝死，心肌肥大是心血管疾病发病率和死亡率增高的主要原因之一[9]。因此防治心肌肥大对改善预后具有重要临床意义。

Postn是一种由四个Fasciclin结构域组成的分子量为90 kDa的异功能分泌型细胞外基质蛋白，研究表明，Postn在调节长期压力超负荷刺激和心肌梗死后的心肌肥大、间质纤维化和心室重构方面起着至关重要的作用[10-11]。研究显示，在心肌细胞中，细胞外基质中的Postn可能会诱导TGF-β1的合成，激活TGF-β/NF-κB信号通路促进心肌肥大。由此可见，Postn/TGF-β/NF-κB信号通路在心肌细胞肥大中发挥重要作用，调节Postn的活性对于防治心肌肥大具有较大潜力。CGA广泛存在于植物中，以金银花、杜仲中的含量较高，具有广泛的药理作用，如具有降低血压、恢复血管弹性和保护心脏等多种作用[12]。综合现有研究表明，CGA在心肌肥大的治疗中无论单独治疗还是联合其他药物使用均表现出极大的潜质，课题组前期研究发现CGA能够显著抑制Postn和TGF-β1的mRNA表达并抑制心肌肥大，且二者存在正相关性关系，但CGA对Postn和TGF-β1的抑制机制尚不清楚。AngⅡ是调节血压和体液的重要激素，可通过升高血压或直接刺激心肌成纤维细胞增殖，诱导心肌细胞肥大，因此，本研究采用AngⅡ构建心肌肥大细胞模型，通过加以CGA和(或)Postn干扰，观察其对心肌细胞表面积，活力及凋亡的影响，同时观察Postn/TGF-β/NF-κB信号通路相关蛋白变化，结果显示，与对照组相比，模型组细胞表面积明显下降，存活率明显下降，凋亡率明显增加，而分别给予CGA或Postn-siRNA后，上述指标变化均得到明显逆转，提示CGA或Postn-siRNA可以增加心肌肥大细胞活力，抑制凋亡，而同时给予CGA和Postn-siRNA干预，上述指标均与对照组无明显差异，表明Postn通路参与CGA抑制的心肌肥大作用。为了进一步研究CGA对Postn/TGF-β/NF-κB通路的作用，本研究分别采用Western blot和RT-PCR检测此通路相关蛋白及mRNA表达情况，结果显示，给予CGA或Postn-siRNA后Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1蛋白及mRNA表达、ANP、BNP和β-MHC蛋白表达均明显下调(P<0.05)，表明CGA通过抑制Postn结合整合素α3、α5、β3、β5而抑制TGF-β/NF-κB核因子信号通路，从而减少释放ANP、BNP和β-MHC，发挥抑制心肌肥大作用[4]。

综上所述，绿原酸介导Postn/TGF-β/NF-κB通路调控细胞活性和凋亡，进而抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，在抑制心肌肥大进展过程中发挥重要作用。也为将Postn介导的TGF-β/NF-κB通路作为防治心肌肥大的分子靶点提供了新的科学依据，也进一步了解绿原酸在心肌肥大中的防治机制。