R8 修饰盐酸柔红霉素/和厚朴酚脂质体的制备及抗肿瘤活性评价

陈 毅，邬 俊，王 贵，李 双，王唯婷，李学涛，王晓波*

（1.大连医科大学 药学院，辽宁 大连 116044；2.中国人民解放军联勤保障部队第967 医院 药剂科，辽宁 大连 116021）

在全球范围内男性癌症患者中，肺癌是仅次于前列腺癌的第二大常见癌症。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%，约75%的患者发现时已处于中晚期，患者的5 年生存率很低[1-2]，且部分患者已经发生了癌症转移。

R8（八精氨酸）是一种细胞穿膜肽，是一种能携带大分子物质进入细胞的短肽，能够促进细胞对大分子的摄取[3]。盐酸柔红霉素（Daunorubicin，DNR）是一种在白血病治疗中比较常见的药物，但是因患者对DNR 较易产生耐药性和其强烈的骨髓抑制、心脏毒性等严重不良反应，使得该药物的使用受到一定限制。和厚朴酚（Honokiol，HNK）是中药厚朴干皮中的一种联苯二酚类化合物，已有研究表明HNK 能够通过下调间充质标志物的表达和上调上皮标志物的表达来抑制上皮间质转化。此外，HNK 具有下调多种基质金属蛋白酶的作用[4]。但上述两种药物都有半衰期短、口服生物利用度低等缺点，由于两种药物都有较好的抗肿瘤活性，因此可以通过尝试改变药物在体内的传递方式来解决其中的一些问题。药物递送的最终目标是通过在特定作用部位释放有效药物成分来提高生物利用度并减少其毒副作用。近年来，脂质体一直是剂型开发中较为重视的药物递送系统之一[5]，脂质体可以将各种活性化合物封装在其脂质双层或亲水性核心中。若以一些特定的配体进行修饰，既可以提高药物的肿瘤靶向性，也可以增加生物利用度，减小药物的副作用[6]。本研究制备了R8穿膜肽修饰的DNR/HNK 脂质体，并对制备的脂质体能否有效的被摄取以及该脂质体的体内外抗肿瘤活性进行研究，以期为药物开发提供新思路。

1 材料与试剂

人非小细胞肺癌细胞（A549）获得于中科院细胞库（中国上海）。细胞培养在含有10 %胎牛血清（Gibco；Thermo Fisher Scientific, Inc.） 和 100 U/mL青霉素和100µg/mL 链霉素（Gibco；Thermo Fisher Scientific, Inc.） 的DMEM（Gibco；Thermo Fisher Scientific, Inc.）的完全培养基中。长链二烷基羰花青化合物（DiR，KGMP0026）购自江苏凯基生物技术股份有限公司；盐酸柔红霉素（DNR，MB1074-2）和厚朴酚（HNK，MB5989-2）购自大连美仑生物科技有限公司；DSPE-PEG2000-R8（辽宁中医药大学药剂教研室合成并提供）。

YA1071 透析袋（北京索莱宝科技有限公司）；Mastersizer3000 激光粒径测定仪（英国Malvern 公司）；葡聚糖凝胶SephadexG-50 柱（上海华蓝化学科技有限公司）；MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF 的ELISA 试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；卵磷脂（L8260，北京索莱宝科技有限公司）；胆固醇（C8280，北京索莱宝科技有限公司）；试验用水为超纯水。

2 方法

2.1 脂质体的制备及理化性质考察

2.1.1 脂质体的制备 采用薄膜分散法-硫酸铵梯度法[7]制备脂质体。在圆底烧瓶中加入处方量的胆固醇4 mg、卵磷脂22 mg、DSPE-PEG2000 2 mg、DSPE-PEG2000-R81 mg、HNK 2 mg 与甲醇混匀，超声使之溶解，在40 ℃水浴下减压蒸发至形成一层薄膜，加入5 mL 250 mM/L（NH4）2SO4溶液并超声处理使薄膜溶解，然后将其转移至10 mL EP 管中，用超声波细胞破碎机超声10 min（500 W），混悬液用0.22 μm 微孔滤膜过滤两次，随后转移至透析袋（截留分子量12 000 ～ 14 000 Da）在PBS溶液中透析24 h，每8 h 更换一次PBS。

在圆底烧瓶中加入处方量的DNR 1 mg 与上述透析完成的脂质体于40 ℃水浴中振摇20 min，即得R8-DNR/HNK 脂质体。处方中不加入DNR/HNK，其余操作步骤同上，即得R8-空白脂质体。处方中不加入DSPE-PEG2000-R8，其余操作步骤同上，即得DNR/HNK 脂质体。处方中不加入DSPE-PEG2000-R8和HNK，其余操作步骤同上，即得DNR 脂质体。处方中不加入DSPE-PEG2000-R8和DNR，超声破碎机超声完毕即得HNK 脂质体。

2.1.2 脂质体包封率的测定 取500 μL R8-DNR/HNK 脂质体至凝胶柱上方，加入PBS 进行洗脱，当液体出现红色时开始用5 mL 容量瓶收集，直至红色完全流出即收集完毕。向容量瓶中加入PBS 缓冲液定容至5 mL，混匀。精密吸取500 μL 于EP 管中，再加入等体积甲醇溶液破乳。按照各自色谱条件分别测定溶液中DNR 和HNK 浓度，并分别计算脂质体中两种药物的含量。

另取500 μL R8-DNR/HNK 脂质体至5 mL 容量瓶中，用PBS 定容。精密吸取500 μL 于EP 管中，再加入等体积甲醇溶液破乳。按照HPLC 条件分别测定溶液中DNR 和HNK 浓度，并分别计算两种药物总含量。根据如下公式分别计算脂质体中DNR 和HNK 的包封率：包封率（%） =W1/W0× 100%。其中，W1为脂质体中药物含量，W0为总药物含量。

2.1.3 脂质体的理化性质表征 吸取制备的脂质体溶液适量，以PBS 溶液稀释50 倍。取稀释后的脂质体溶液适量，滴加至专用铜网上，以用体积分数为2%磷钨酸溶液染色，室温晾干，然后置于透射电子显微镜上（加速电压：120 kV）观察其形态[8]。

采用激光散射粒径测定仪测定脂质体的粒径等指标，取脂质体溶液200 μL，使用激光散射粒径测定仪测定脂质体的粒径及Zeta 电位（每次设定循环10 次）[9]。

2.2 细胞活力测定

A549 细胞在96 孔板（2 × 104个/孔）中37℃孵育箱过夜，并用R8-空白脂质体、DNR 脂质体、HNK脂质体、DNR/HNK 脂质体、R8-DNR/HNK 脂质体分别处理细胞48 h（使得各组柔红霉素终浓度为1.093 75、2.187 5、4.375、8.75、17.5、35 和70 µM/mL）。每孔共加入20 μL CCK8，将96 孔板于37°C 再培养3 h 后在酶标仪测定450 nm 波长处的吸光度，每组设置4 个复孔。计算细胞存活率：细胞存活率（%） =OD给药组/OD空白对照组× 100%。结果使用 Graphpad-Prism-5 软件计算各组脂质体的半数抑制浓度（IC50）。

2.3 伤口愈合测定

A549 细胞在6 孔板（6 × 105个/孔）中37℃孵育箱过夜，待其生长融合至80% ～ 90%，用200 μL移液器吸头在孔中小心地划出一个伤口，弃去完全培养基，然后用 PBS 清洗两次以除去漂浮细胞。分别加入DNR 脂质体、HNK 脂质体、DNR/HNK 脂质体、R8-DNR/HNK 脂质体，使得体系中DNR 终浓度为7 µM/mL，HNK 终浓度为17.5 µM/mL，空白对照组加入相同体积的培养基，各组在含有体积分数为1%血清培养液中继续孵育24 h，使用倒置显微镜分别获取0、12 和24 h 迁移图像并分析。

2.4 Transwell 迁移实验

A549 细 胞 在6 孔 板（6 × 105个/孔）中37 ℃孵育箱过夜，弃去完全培养基，然后用 PBS 清洗两次，随后胰酶消化，离心后用无血清培养基重悬细胞，计数调整细胞使得Transwell 小室内细胞为4 ×104个。分别加入DNR 脂质体、HNK 脂质体、DNR/HNK 脂质体、R8-DNR/HNK 脂质体，使得DNR 终浓度为7 µM/mL，HNK 终浓度为17.5 µM/mL，空白对照组加入相同体积的培养基，将细胞悬液与各组别脂质体混合加入上室，使得上室体积为200 μL，下室添加700 μL 含有体积分数为15% FBS 的培养基作为诱引剂。孵育箱中孵育48 h，用棉签刮去上室没有迁移的细胞，小室膜外侧细胞用4%多聚甲醛固定15 min，用质量分数为0.4%结晶紫室温染色20 min，使用倒置显微镜获取图像。

2.5 酶联免疫吸附法测定MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF 的表达

A549 细胞在6 孔板（6 × 105个/孔）中37 ℃孵育箱过夜，分别加入DNR 脂质体、HNK 脂质体、DNR/HNK 脂质体、R8-DNR/HNK 脂质体，使得DNR终浓度为7 µM/mL，HNK 终浓度为17.5 µM/mL，分别处理细胞24 h。用预冷的PBS 清洗细胞，含有1%PMSF 的RIPA 细胞裂解液裂解细胞并收集细胞总蛋白。使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定各样品蛋白浓 度。使 用MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF 四 种ELISA检测试剂盒来定量分析四种蛋白质的表达情况。

2.6 体外摄取

使用流式细胞仪考察脂质体在体外的摄取情况，将A549 细胞在6 孔板（5 × 105个/孔）中37℃孵育箱过夜，分别使用游离DNR（终浓度为7 µM/mL），DNR 脂质体（终浓度为7 µM/mL），R8-DNR/HNK脂质体（终浓度为7µM/mL）处理细胞1、2、3 h。弃去培养基，用PBS 清洗除去悬浮的细胞，用胰酶消化各孔细胞，离心弃去培养基，用PBS 重悬细胞，进入流式细胞仪进行检测。

2.7 体内摄取

2.7.1 荷瘤小鼠模型建立 取对数生长期的A549细胞胰酶消化，进行细胞计数，取5 × 106个细胞混悬于200 μL 生理盐水中，小鼠腋下注射，继续饲养10 d，每天观察并用游标卡尺测量瘤体大小，待肿瘤体积达到90 mm3时，进行后续实验。

2.7.2 DiR 脂质体的制备 采用活体成像实验考察脂质体的体内靶向性。将DNR 药物替换为DiR，分别制备DiR 脂质体和R8-DiR/HNK 靶向脂质体，卵磷脂和DiR 的比例为200 ∶1（w/w），按“2.1.1”项下方法制备。

2.7.3 体内摄取 当荷瘤小鼠成功造模后，对各组荷瘤小鼠分别尾静脉注射游离DiR、DiR 脂质体和R8-DiR/HNK 脂质体，空白对照给予生理盐水，每组3 只。各给药组的DiR 剂量均为2 μg/只。使用光学成像系统分别于给药后1、3、6、12 和24 h对小鼠进行荧光成像并观察记录。

2.8 统计学方法

用SPSS 22.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 R8-DNR/HNK 脂质体制备的最优处方及理化性质表征

运用星点设计-响应面法以及本实验室制备经验[10]，确定脂质体的最优处方为：卵磷脂22 mg、胆固醇4 mg、DNR 1 mg、HNK 2 mg、处方量为5 mL。根据最优处方制备的脂质体计算得DNR 平均包封率为（93.53 ± 0.17） %，HNK平均包封率为 （87.27 ± 0.58） %，两药平均包封率为（91.73 ± 0.11）%。符合2020 年版《中国药典》（四部）对微粒制剂包封率不低于80%的要求。脂质体的粒径为（87.17 ± 1.19）nm（n= 3），Zeta 电位为（-2.0 ± 0.9）mV（n= 3）, 形态呈圆形，粒径均一，分散均匀，结果见图1。

3.2 细胞活力测定

R8-空白脂质体没有细胞毒性，HNK 作为脂质体调节剂，低浓度情况下对细胞几乎无毒，DNR 脂质体的细胞毒性随着剂量的加大而增大，R8-DNR/HNK 脂质体对A549 细胞的毒性最强，以脂质体中DNR 浓 度 计 算，IC50为（9.79 ± 0.87）µM/mL；而DNR/HNK脂质体的IC50为（11.57 ± 0.88） µM/mL。以上结果表明，R8修饰的脂质体对A549 细胞有明显的抑制作用（P＜0.05），见图2。

3.3 伤口愈合试验和Transwell 试验

为了验证本研究制备的脂质体是否能在体外抑制A549 细胞的侵袭和转移，采用了伤口愈合试验和Transwell 试验。靶向材料修饰的脂质体能显著抑制A549 细胞的迁移，并且这种作用明显大于无靶向材料修饰脂质体（P< 0.05）。Transwell 试验也表明R8修饰的脂质体能更好的抑制细胞的迁移（P< 0.05），这与伤口愈合试验结果一致，见图3。

3.4 酶联免疫吸附法测定MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF 的表达

MMP-2、MMP-9、VEGF和bFGF蛋白通过ELISA试剂盒检测。DNR/HNK 脂质体和R8-DNR/HNK 脂质体处理组的MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF 蛋白表达均明显降低（P< 0.05），其中R8-DNR/HNK脂质体的降低幅度最大，见图4。

3.5 体外摄取

各组细胞对药物的吸收量为：游离的DNR ＞R8-DNR/HNK 脂质体＞DNR 脂质体＞R8-空白脂质体对照组。结果表明：R8-DNR/HNK 脂质体在A549细胞中吸收最好。由于DNR 的糖苷配基是荧光发光基团，因此选择制备上述三种脂质体。结果表明以R8为靶向材料可以增加细胞对药物的摄取，见图5。

3.6 体内药物摄取

给予荷瘤裸鼠各组别脂质体后进行活体图像，来评估药物在荷瘤小鼠的体内分布，同时比较不同组间的荧光强度差别。对于DiR 游离药在1 h 时即能检测到强荧光，但随着时间推移荧光强度降低较大，而靶向材料修饰的脂质体组在24 h 时仍能检测到荧光信号，同时靶向材料修饰的脂质体组在给药初期能更好的在体内分布。上述结果表明R8修饰的脂质体在荷瘤小鼠体内循环时间最长，并在肿瘤部位明显积累，这可能是DSPE-PEG2000 的加入和R8的修饰增加了脂质体的水溶性和靶向性，从而增加了脂质体的主动靶向性，见图6。

4 讨论

本研究构建了R8-DNR/HNK 脂质体，并对脂质体的包封率、粒径、Zeta 电位等理化性质进行表征。结果表明，脂质体的各项理化指标都在合理范围内，脂质体形态呈均匀的圆形，粒径均在100 nm 左右，这个粒径大小有助于脂质体通过EPR 效应在肿瘤部位聚集。同时对脂质体的抗肿瘤作用进行了评价，分别考察了所制备的5 种脂质体对A549 的细胞毒性，R8-空白脂质体没有细胞毒性，这也说明载药脂质体产生的细胞毒性由药物自身引起的。通过考察脂质体作用后转移相关蛋白MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF 表达的变化，探索了制备的脂质体抑制迁移的潜在机制。MMP-2、MMP-9 具有破坏基底膜，促进癌细胞迁移的作用，因此，抑制这两种蛋白的表达对于抑制肿瘤转移具有重要意义。最后考察了脂质体在体内的长循环效应，制备的脂质体能延长药物在体内的蓄留时间，在肿瘤部位的药物浓度也得到了明显提升。

R8-DNR/HNK 脂质体具有良好的抗肿瘤效果主要可能依赖以下三个方面：1. 构建的脂质体具有理想的理化性质；2. R8作为靶向材料对脂质体表面进行修饰，大大增加了药物在肿瘤部位的蓄积和肿瘤细胞对药物的摄取；3. HNK 作为调节剂，增强化疗药物的作用，主要通过调节相关蛋白（MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF）来增强对非小细胞肺癌细胞的抑制作用。

5 结论

根据最优处方制备的脂质体能够通过多方面因素在体外明显抑制A549 细胞的生长以及侵袭，同时能明显提高肿瘤细胞对药物的摄取能力，增加药物在体内的循环时间。本研究初步确定了制备的脂质体的抗肿瘤活性，为后续药物剂型开发提供了理论依据。

收稿日期：2021-12-09