基于HPLC 指纹图谱及9 个成分含量测定的通天口服液质量评价研究

2022-09-19米卓尔崔雨晴陈方超周丹丹沙禕炜

现代中药研究与实践 2022年4期

米卓尔，崔雨晴，陈方超，周丹丹，沙禕炜

[鉴甄检测技术（上海）有限公司，上海 200131］

通天口服液是以出自宋代的《太平惠民和剂局方》中医经典名方“川芎茶调散”为基础的中药制剂[1]，由川芎、赤芍、天麻、羌活、白芷、细辛、菊花、薄荷、防风、茶叶、甘草等11 味中药组成，具有活血化瘀、祛风止痛之功效[2]。现代临床研究表明，通天口服液主要用于偏头痛的治疗[3-6]，具有抗炎作用[7]。此外，其对于脑梗死恢复期也具有良好疗效[8]。

2020 年版《中国药典》（一部）中通天口服液仅对芍药苷进行质量控制，已有文献报道的测定方法也存在一定的局限性，如选择指标性成分不够全面[9-13]、测定时间较长[1]等。中药复方往往是多成分协同发挥作用起到疾病防治的效果，多味药多组分的质量控制可以更好地体现其质量的整体性和系统性。本研究以君、臣药为主，兼顾佐使药的原则，采用多成分定量结合指纹图谱的方法，建立了通天口服液的指纹图谱方法，对21 个共有峰进行标定；同时对其中9 个活性成分进行定量控制（咖啡因、芍药苷、升麻素苷、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸铵、藁本内酯）。该方法简单、可靠、耐用性良好，可更加全面、系统地控制通天口服液的质量。

1 仪器与试药

Waters Alliance e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司)；乙腈和甲醇（色谱纯，dama-betas）；磷酸（色谱纯，Fisher）；甲醇和乙醇（分析纯，上海泰坦科技）；超纯水（实验室制备）；没食子酸对照品（批号：110831-201906，纯度：91.50%）、对羟基苯甲酸对照品（批号：101149-201903，纯度：100.00%）、绿原酸对照品（批号：110753-202018，纯度：96.1%）、木犀草苷对照品（批号：111720-201810，纯度：93.50%）、紫花前胡苷对照品（批号：111821-201604，纯度：99.60%）、迷迭香酸对照品（批号：111871-202007，纯度：98.10%）、蒙花苷对照品（批号：111528-202112，纯度：98.00%）均购自中国食品药品检定研究院；升麻素苷对照品（批号：7969，纯度：94.60%）、异绿原酸A 对照品（批号：7123，纯度：93.60%）、水合氧化前胡素对照品（批号：9028，纯度：99.70%）、芹菜素-7-O-葡萄糖苷对照品（批号：8779，纯度：98.90%）、藁本内酯对照品（批号：8155，纯度：97.40%）均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；咖啡因对照品（批号：PRF20030243，纯度：98.88%）、新绿原酸对照品（批号：PRF10080702，纯度：98.00%）、芍药苷对照品（批号：PRF10110102，纯度：98.77%）、氧化芍药苷对照品（批号：PRF21012822，纯度：98.00%）、巴利森苷B 对照品（批号：PRF21030901，纯度：98.00%）、异绿原酸B 对照品（批号：PRF20070205，纯度：98.00%）、异绿原酸C 对照品（批号：PRF20022503，纯度：98.00%）、甘草酸铵（批号：PRF20011002，纯度：99.63%）均购自成都普瑞法科技开发有限公司。15 批通天口服液S1-S15（批号：19080030、19080031、19080032、19080033、19080034、9080035、19080036、19080037、19080038、19080040、19080041、19080042、19080043、19080044、19080045）以及阴性制剂均由太极集团重庆涪陵制药厂有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取20 个对照品适量，精密称定，分别加75%甲醇制成各成分含量约为0.5 mg/mL 的储备液。分别精密吸取各个储备液适量，用75%甲醇水稀释制成合适浓度的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精密量取本品1 mL，置5 mL 容量瓶中，加75%甲醇水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。阴性样品溶液同法制备。

2.3 色谱条件

Waters XSelect CSH C18柱（4.6 mm × 150 mm，3.5 µm）；流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）（V/V），梯度洗脱（0 ～ 4 min，4%A；4 ～ 10 min，4%→10%A；10 ～ 14 min，10%→13%A；14 ～ 20 min，13%A；20 ～ 22 min，13% →17%A；22 ～ 30 min，17%→18%A；30 ～ 38 min，18%→25%A；38 ～ 50 min，25%→35%A；50 ～ 53 min，35%→45%A；53 ～ 63 min，45%→68%A；63 ～ 64 min，68%→95%A；64 ～ 66 min，95%A；66 ～ 67 min，95% →4%A；67 ～ 70 min，4%A），记录时间：65 min；流速：0.8 mL/min；二极管阵列（PDA）检测器；检测波长为230 nm （芍药苷）、254 nm （升麻素苷、甘草酸铵、指纹图谱）、280 nm （咖啡因）、315 nm （紫花前胡苷、水合氧化前胡素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、藁本内酯）；柱温为30℃；进样量为10 µL。

2.4 指纹图谱测定

2.4.1 精密度试验精密吸取供试品溶液，按“2.3”项连续进样6 次，记录色谱图。结果表明，以3 号峰（咖啡因）为参照峰S，21 个共有峰的相对保留时间 RSD 在0.01%～0.29%，相对峰面积RSD在0.33% ～ 3.42%，表明该仪器精密度良好。

2.4.2 专属性试验取空白、对照品、供试品、阴性样品溶液按“2.3”项进样分析，结果见图1。空白溶液对测定无干扰，指认的色谱峰的紫外光谱图与对照品一致，各峰之间分离度良好，表明方法专属性良好。

2.4.3 重复性试验取同一批次样品（批号：19080040），按“2.2”项方法平行制备 6 份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样，以3 号峰（咖啡因）为参照峰S，21 个共有峰相对保留时间RSD 在0.01% ～0.26%之间，相对峰面积RSD 在0.19% ～ 3.67%之间，表明方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验取同一供试品溶液（批号：19080040），分别在室温下放置0、3.5、7、10.5、14、24 h，按“2.3”项下色谱条件进样分析。以3 号峰（咖啡因）为S，21 个共有峰相对保留时间的RSD 在0.10%～2.16%，相对峰面积RSD 在0.80%～4.32%，表明样品在 24 h 内的稳定性良好。

2.4.5 指纹图谱的建立与共有峰的标定按“2.3”项下条件测定对照品及供试品溶液，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.13723版本）”软件对15 批通天口服液指纹图谱进行处理，建立了对照指纹图谱，见图2。经Mark 峰匹配后，确定了21 个共有峰，通过比对各对照品的保留时间及PDA 光谱图，指认出19 个峰，峰3（咖啡因）归属于茶叶，峰4（氧化芍药苷）和峰7（芍药苷）归属于赤芍，峰8（升麻素苷）归属于防风，峰9（紫花前胡苷）和峰19 归属于羌活、峰10（木犀草苷）、峰11（芹菜素-7-O-葡萄糖苷）、峰12（异绿原酸B）、峰13（异绿原酸A）、峰15（异绿原酸C）归属于菊花，峰14（迷迭香酸）和峰17（蒙花苷）归属于薄荷，峰16（水合氧化前胡素）归属于白芷和羌活，峰18（甘草酸铵）归属于甘草，峰20（藁本内酯）和峰21 归属于川芎。相似度结果见表1，结果表示，15 批供试品与相似度均大于0.95，表明15 批通天口服液的主要化学成分具有较好的一致性。

表1 15 批通天口服液相似度Tab. 1 Similarity of 15 batches of Tongtian oral solution

2.5 多成分含量测定

2.5.1 线性关系考察取混合对照品溶液（咖啡因167.7μg/mL、芍药苷461.3μg/mL、升麻素苷16.2μg/mL、紫花前胡苷191.1μg/mL、芹菜素-7-O-葡萄糖苷20.0μg/mL、水合氧化前胡素14.5μg/mL、蒙花苷48.6μg/mL、甘草酸铵30.5μg/mL、藁本内酯14.3μg/mL），用75%甲醇逐级稀释配制为7 个不同浓度，按“2.3”项下条件进样分析。以质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程及线性范围，见表2。结果表明各自成分在各线性范围内线性关系良好。

表2 通天口服液中 9 个成分的回归方程及线性范围Tab. 2 Regression equation and linear range of 9 components in Tongtian oral solution

2.5.2 精密度试验取供试品溶液（批号：19080040），按“2.3”项下连续进样 6 次分析，记录峰面积。结果表明，咖啡因、芍药苷、升麻素苷、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸铵、藁本内酯峰面积的RSD 值分别为0.34%、0.46%、0.43%、0.28%、0.37%、0.27%、0.38%、0.99%、0.94%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验取同一供试品溶液（批号：19080040），分别在室温下放置0、3.5、7、10.5、14、24 h，按“2.3”项下条件进样分析，咖啡因、芍药苷、升麻素苷、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸铵、藁本内酯峰面积的RSD 值分别为0.81%、1.07%、1.31%、1.10%、1.22%、1.30%、0.95%、1.02%、0.61%，表明样品在24h 内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验取同一批次样品（批号：19080040），按“2.2”项方法平行制备 6 份供试品溶液，按“2.3”项下条件进样，记录峰面积。咖啡因、芍药苷、升麻素苷、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸铵、藁本内酯峰面积的RSD 值分别0.29%、0.32%、0.59%、0.41%、2.43%、0.58%、0.69%、0.40%、0.89%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收试验取已知含量的通天口服液0.5 mL（批号：19080040），精密加入3 mL 的混合对照品溶液（咖啡因0.063 mg/mL、芍药苷0.157mg/mL、升麻素苷0.003 g/mL、紫花前胡苷0.072 mg/mL、芹菜素-7-O-葡萄糖苷0.008 mg/mL、水合氧化前胡素0.005 mg/mL、蒙花苷0.015 mg/mL、甘草酸铵0.016 mg/mL、藁本内酯0.004 mg/mL），加入75%甲醇定容至刻度（加入量与所取通天口服液中各指标成分量之比为1 ∶1）,按“2.3”项下条件进样，计算回收率，结果见表3。各成分的回收率和RSD 均符合标准，表明方法准确度良好。

表3 通天口服液中 9 个成分的加样回收试验结果（n = 6）Tab. 3 The results of recoveries of 9 chemical components in Tongtian oral solution（n = 6）

2.5.6 样品的测定精密移取15 批样品，按照按“2.2”项方法制备供试品溶液，平行制备3 份，按“2.3”项下进样，记录峰面积。咖啡因、芍药苷、升麻素苷、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸铵、藁本内酯的含量及RSD 值见表4。

表4 15 批通天口服液中 9 个成分含量测定结果（n = 3）Tab. 4 The results of 9 components in 15 batchs of Tongtian oral solution（n = 3）

3 讨论

3.1 指标成分的选择

通天口服液组方中，川芎活血祛瘀、行气开郁、祛风止痛为君药。羌活、白芷、天麻合用，解表散寒、祛风胜湿，与川芎相须配伍，共为臣药；赤芍、薄荷、防风、菊花、细辛共为佐药。甘草、茶叶调和诸药，兼为使药。诸药合用，共奏祛风止痛、通畅气血之功。为了整体地、全面地评价通天口服液的质量，本研究以君臣为主，兼顾佐使的原则，选择咖啡因、芍药苷、升麻素苷、紫花前胡苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、水合氧化前胡素、蒙花苷、甘草酸铵、藁本内酯 9 个指标性成分进行定量研究。本研究所建立的指纹图谱结合同步测定9 种成分的定量的方法，全面涵盖了君臣佐使药的化学定量信息，可整体性地评价通天口服液的内在质量。

3.2 色谱条件的确定

以色谱峰数量及响应强度作为指纹图谱检测波长选择的指标，最终确定为254 nm 作为指纹图谱的检测波长。天麻中巴利森苷B 的最大紫外吸收波长为230 nm，因其在制剂中的含量较低，故在254 nm 无法检测。

参考各对照品的最大吸收波长，最终确定以230、254、280、315 nm 作为9 个成分含量测定的检测波长。甲醇的洗脱能力较乙腈弱，且柱压较高，从节约时间和保护色谱柱寿命的角度考虑，故选择使用乙腈-水体系。采用乙腈-水洗脱时，色谱峰整体图谱较差，基线漂移，且无法检测甘草酸。通过加酸来调节流动相的pH 值：考察乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.01%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液对色谱峰的影响。与甲酸相比，磷酸可使基线更加平稳，其中0.05%磷酸水溶液呈现较好的色谱行为。考察不同的色谱柱对样品的分离效果，发现Waters X-select CSH C18柱最优，尤其对紫花前胡苷的分离具有良好效果，可达到基线分离。

3.3 对测定结果的思考

15批通天口服液的指纹图谱相似度均大于0.95，产品整体批间差异不大，指纹图谱方法可行，为提高通天口服液内在质量标准提供参考依据。由9 个成分含量测定结果可知，挥发性成分蒙花苷、藁本内酯不同批次含量差异较大，分析其原因可能是生产所用原药材的质量差异较大，例如药材的生产基地、采收时间、运输条件及储存条件不同导致，此结果可为企业控制药材来源提供数据支撑，更好地把控药材来源。