基于网络药理学和分子对接研究大叶桃花心木柠檬苦素治疗糖尿病的机制

徐泽荣，金文芳，孙云鹏，刘劲松,2,3，王国凯,2,3*

（1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012；2.中药研究与开发安徽省重点实验室，安徽 合肥230012；3.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012）

糖尿病在中医上被称为消渴症，它是由于胰岛β 细胞不能正常分泌胰岛素，使胰岛素相对或绝对不足而引起的。目前，糖尿病是除了心血管疾病、肿瘤以外的第三大疾病，严重影响了人们的生活和健康。现在医学上对糖尿病病因尚未完全明确，可能与环境、遗传、自身免疫等原因有关。据相关文献报道，近些年来，糖尿病发病程度逐渐趋于严重化及患病人群逐渐趋于年轻化[1]。目前，临床上用于治疗糖尿病的药物作用靶点单一、耐药性和副作用等问题一直存在[2]。因此，研究糖尿病的病理机制及寻找安全、低毒、高效的药物尤其重要。

大叶桃花心木为楝科桃花心木属植物，别名美洲红木，因其提取物和单体化合物表现出多种生物活性备受研究者关注[3-4]。近些年，从大叶桃花心木树叶、树皮以及果实中分离得到大量的柠檬苦素类化合物。柠檬苦素为降三萜类化合物[5]，药理学研究表明柠檬苦素除了具有抗氧化[6]、抗肿瘤[7]、抗真菌[8]和抗病毒[9]等生物活性外，还具有良好的降糖作用[10]。虽然有文献报道柠檬苦素具有明显降血糖效果，然而，对于其治疗糖尿病的活性成分和作用机制仍缺乏了解。

网络药理学是在大数据的背景下，通过对网络数据库的多方面挖掘，来研究药物与疾病之间存在的潜在复杂关系。利用网络药理学来预测中药治疗糖尿病的作用机制和筛选活性成分的研究近些年来不胜枚举，本研究旨在借助网络药理学方法，并通过分子对接技术进行验证，探究大叶桃花心木柠檬苦素治疗糖尿病的生物学机制，同时希望能够筛选出降糖活性更好的柠檬苦素类化合物，为后续疾病的研究和药物研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 大叶桃花心木柠檬苦素活性成分收集和相关靶点的筛选

通过检索相关文献获得大叶桃花心木柠檬苦素化合物的化学结构[11]，利用ChemBioDraw 画出这些化合物化学结构式并导入到Swiss ADME 中，以同时满足高胃肠吸收（GI absorption high）和类药性（Druglikeness）五个条件中两个yes 为标准进行筛选，筛选后的化合物导入Swiss Target Prediction 数据库（http://swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测。

1.2 糖尿病相关靶点的收集

分 别 在GeneCards（http://www.genecards.org/）、OMIM（http://www.omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、Drugbank（https://go.drugbank.com/）及PharmGkb（https://www.pharmgkb.org/）等网络数据库中检索“diabetes”，获取糖尿病疾病相关靶点。整合以上数据库中获得的靶点，除去重复项，建立疾病靶点数据库。

1.3 药物与疾病交集靶点的筛选

将药物靶点和疾病靶点基因名上传至Venny 2.1.0平台（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），取二者交集，获得柠檬苦素治疗糖尿病的共有靶点的韦恩图。

1.4 药物-靶点网络关系的构建

为更清楚直观的表明大叶桃花心木柠檬苦药物靶点和糖尿病疾病靶点之间的联系，将获得的共有靶点和筛选后的化合物导入到Cytoscape 3.7.1 软件中构建柠檬苦素-靶点相互作用网络。

1.5 药物-疾病靶点蛋白相互作用网络图的构建

将得到的药物与疾病的共有靶点导入String 数据库（https://string-db.org/cgi/）进行在线分析，建立药物靶点-疾病靶点相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图，并根据度值（Degree）大小筛选治疗疾病的关键靶点。

1.6 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

采用计算机R 语言中clusterProfiler 程序包，以P＜0.05为筛选条件对交集靶点进行GO富集和KEGG通路分析，并进行可视化处理。

1.7 大叶桃花心木柠檬苦素与糖尿病关键靶点分子对接

选择药物-疾病靶点相互作用网络中度值较大的5 个关键靶点与其对应的活性成分进行分子对接，利用ChemBio3D 对化合物能量最小化处理后保存为mol 2 格式。在PDB 数据库(https://www.rcsb.org/structure)中下载关键靶点蛋白的pdb 格式，利用Pymol Win软件进行去水去配体处理后保存。利用Autodock Vina 软件将治疗糖尿病的关键靶点与相应的活性化合物进行分子对接。分子对接成功后，其结果利用Discovery Studio 软件进行可视化处理。另外，将选择的关键靶点蛋白的原共晶配体提取出来再与原来的蛋白进行自对接，来评估对接方法的准确性和可靠性，通过比较原共晶配体的坐标体系计算均方根偏差（RMSD）,当RMSD ≤2.0 Å，表示对接结果可靠。

2 结果

2.1 大叶桃花心木柠檬苦素活性成分收集和相关靶点的筛选

检索相关文献，共得到117 个大叶桃花心木柠檬苦素类化合物，其中有26 个柠檬苦素通过了Swiss ADME的筛选，能预测到靶点的化合物有25 个，见表1。利用Swiss Target Predition 共预测到药物潜在靶点431 个；GeneCards、OMIM、TTD 等数据库预测到糖尿病相关靶点个数，见表2，去重后共获得疾病靶点1 314 个。最后，将上述药物靶点与疾病靶点进行对比匹配，获得与柠檬苦素治疗糖尿病相关的共有靶点132个，见图1。

表1 通过筛选的26 个柠檬苦素基本信息Tab. 1 Basic information of screened 26 limonoids

表2 不同数据库收集到的疾病靶点个数Tab. 2 Number of disease targets collected from different databases

将通过筛选的化合物与上述得到的132 个共有靶点上传至Cytoscape 3.7.1 软件，获得柠檬苦素-靶点相互作用网络图，见图2。

2.2 大叶桃花心木柠檬苦素治疗糖尿病核心靶点分析

将得到的132 个共有靶点导入到String 数据库中，最低相互作用阈值取 “medium confidence”（≥0.4）的靶点获得蛋白质相互作用网络关系，再将String 数据库中获得的相关数据导入Cytoseape 3.7.1软件，调整后得到药物与疾病的蛋白相互作用图，见图3。该网络中包含132 个节点和1 050 条边，平均节点度值为15.9。其中，度值较大的靶点有TNF、AKT1、SRC、EGFR、STAT3 等，可认为这些靶点是大叶桃花心木柠檬苦素发挥药效治疗糖尿病的关键靶点，见表3。

表3 柠檬苦素治疗糖尿病的关键靶点信息Tab. 3 Information on key targets of limonoids in the treatment of diabetes

2.3 GO 富集分析

将符合条件的靶点利用clusterProfiler 程序包进行GO 功能富集分析。以P＜ 0.05 为筛选条件，通过R语言绘制气泡图进行可视化处理。排名前10 的GO功能富集分析结果，见图4。GO 富集分析主要是从生物过程（BP）分析、分子功能（MF）分析和细胞组分（CC）分析三个部分来描述基因功能。GO-BP的分析结果进行统计学分析并按照相关度排列，发现大叶桃花心木柠檬苦素主要通过信号释放（signal release）、对药物的反应（response to drug）、肽基-酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation）等生物过程发挥对糖尿病的治疗作用；GO-CC 结果发现大叶桃花心木柠檬苦素主要通过调节膜筏（membrane raft）、膜筏微区（membrane microdomain）、神经元胞体（neuronal cell body）等细胞组分来发挥治疗糖尿病的作用；GO-MF 分析结果分析发现大叶桃花心木柠檬苦素主要通过调节蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、内肽酶活性（endopeptidase activity）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）等分子功能发挥治疗糖尿病的作用。

2.4 KEGG 通路富集分析

将上述得到的132 个共同靶点利用clusterProfiler程序包进行KEGG 通路富集分析。同样以P＜0.05为筛选条件，选择其中显著性最大的20 条通路通过R 语言绘制柱状图进行可视化处理，见图5。

KEGG分析结果表明，共获得158条富集通路（P＜0.05）。排名靠前的20 条通路如图5 所示。为整体考察基因与通路之间的关系，我们取以上富集程度最显著的10 条通路做药物-靶点-通路相互作用网络，见图6。由图可知，一条通路可以富集到多个基因，而一个基因又可以同时出现在多条通路上，表明大叶桃花心木柠檬苦素是通过多通路、多靶点来治疗糖尿病。另外，我们以大叶桃花心木柠檬苦素参与胰岛素信号通路为例，利用R 语言绘制靶点在关键通路中发挥作用过程可视化图，见图7，红色靶点代表大叶桃花心木柠檬苦素中活性成分的关键靶点在该信号通路中所参与的过程，这些靶点在该信号通路中起着关键作用。表明这些关键通路可以作为研究大叶桃花心木柠檬苦素治疗糖尿病的方向。

2.5 成分-靶点分子对接及验证结果

选取度值前5 的关键靶点和其对应的化合物进行了分子对接验证，见表4。结合能小于0，说明受体分子与配体分子能自发结合，结合能绝对值越高，对接能力越强，对接后的分子越稳定。对接结果显示大叶桃花心木柠檬苦素与糖尿病受体蛋白的结合能均小于-6 kcal/mol，说明大叶桃花心木柠檬苦素与关键靶点能较稳定的结合。分子对接可视化结果见图8。

表4 成分-关键靶点的分子对接结果表Tab. 4 Molecular docking results of components and key targets

3 讨论

通过检索文献并利用网络药理学数据库进行活性筛选，共有26 个大叶桃花心木柠檬苦素通过筛选。其中部分化合物已有实验证实其降糖效果。LAU W K 等[12]研究表明6-O-acetylswietenolide 可以通过增加GLUT4 向质膜的转运诱导肌细胞摄取葡萄糖，从而达到降低血糖的效果；DUAN J Y 等[13]研究发现，6-deoxyswietenine、swietenolide、proceranolide 等对胰岛素抵抗的HepG2 细胞有更好的促进作用，swietenolide能显著提高胰岛素抵抗HepG2 细胞PPARγ 蛋白的表达。另外，通过成分-靶点网络图可以得到，6-deoxyswietemahonin A、3-O-acetylswietenolide、swieteliacate B、fissinolide、proceranolide 等化合物节点度值较高，这也提示这几个化合物可能有着更好的降糖作用，有待进一步研究。

大叶桃花心木柠檬苦素治疗糖尿病的蛋白相互作用网络结果提示TNF、AKT1、SRC、EGFR、STAT3 可能是大叶桃花心木柠檬苦素发挥药效治疗糖尿病的关键靶点。其中，TNF 可以损伤胰岛β 细胞，抑制胰岛素信号的传递，进而引起胰岛素抵抗[14]；AKT1 作为胰岛素信号传递的经典因子，可以改善外周细胞中糖代谢的表达水平[15]；SRC 是一种非受体络氨酸激酶，对神经元的增殖和分化有着重要的生理作用[16]；EGFR 可通过多条途径进行信息传递，其激活可增加体内胰岛素循环，增加胰岛素巨噬细胞胰岛自噬，可以维持胰岛结构和功能[17]；STAT3 可参与各种机制，可以在心肌梗死、肥厚、糖尿病性心肌病时起到心脏保护作用[18]。

为了阐明以上筛选出的关键靶点在基因功能和信号通路中的作用，本次研究中对大叶桃花心木柠檬苦素治疗糖尿病的关键靶点进行了通路富集分析。其中，胰岛素信号通路主要是由PI3K/Ras/MAPK2 等多种途径介导发挥效应，当胰岛素信号通路异常时，可引发炎症因子、信号传导因子、脂肪细胞因子等分泌异常干扰胰岛素传递从而导致胰岛素抵抗，胰岛素抵抗是引发糖尿病及其并发症的主要机制之一[19]；有研究表明，糖尿病与前列腺癌有一定的关系，糖尿病患者体内激素如睾酮、胰岛素的改变，可通过PIK3/AKT 途径促进前列腺癌的发生和进展[20]；神经活性配体－受体相互作用通路可通过调节降糖蛋白作为调节糖尿病蛋白的主要通路[21]。钙离子信号通路是参与调控胰岛β 细胞增殖和调亡的重要通路，当钙离子信号通路相关蛋白被激活，可以增加胰岛β 细胞增殖，促进胰岛素分泌[22]；另外，GO 富集分析MF、BP、CC 预测结果，发现大叶桃花心木柠檬苦素可能存在多种途径干预糖尿病的治疗或病程发展。

分子对接结果显示关键靶点与其对应化合物结合能均小于-6 kcal/mol。可视化结果表明，蛋白质受体与活性成分配体多是以氢键、疏水键等产生稳定结合；分子对接结果验证表明，共晶配体与蛋白质对接，RMSD 值均＜2.0 Å，说明对接方法可靠。

4 结论

本研究首次利用网络药理学方法和分子对接技术初步阐明了大叶桃花心木柠檬苦素通过多靶点，多通路的方式来治疗糖尿病的作用机制。筛选得到大叶桃花心木柠檬苦素化合物26 个，取交集后得药物治疗糖尿病的靶点132 个。并分析得到TNF、AKT1、SRC 等可能是柠檬苦素治疗糖尿病的关键靶点。但是本次研究仅是在大数据背景下探讨了大叶桃花心木柠檬苦素治疗糖尿病可能的活性成分及机理，为后续研究提供一定的理论依据，后期仍需开展体内外活性实验对结果的可靠性加以验证。