基于转录组测序技术研究甘草养阴汤增强衰老MH7A 细胞活力

陈 永，汪保江，宋文聪，何 慧，赵 莉，张思为，唐中生，彭 娜，赖文娟，刘冬舟*

[1.暨南大学第二临床医学院（深圳市人民医院） 风湿科，广东 深圳 518020；2.深圳市妇幼保健院妇幼研究所，广东 深圳 518047；3.暨南大学第二临床医学院（深圳市人民医院） 健康管理中心，广东 深圳518020；4.暨南大学第二临床医学院（深圳市人民医院）中医科，广东 深圳 518020；5.贵州中医药大学基础医学院，贵州 贵阳 550025；6.三峡大学第二人民医院 风湿科，湖北 宜昌 443000]

在衰老的研究领域中，细胞老化或衰老显示出与机体衰老的密切相关性，如在诱发原因、免疫原性、表观遗传学和分泌表型上都具有较大的重叠性[1]。细胞衰老的特征表现为细胞周期停滞、扁平或扩大的形态、基因表达和染色质结构的改变、衰老相关β-半乳糖苷酶的表达和衰老相关分泌表型的获得[2]。细胞老化模型也是衰老研究领域常用的手段之一，并发现衰老及细胞衰老可以通过改变代谢和基因重编程（Re-programme）等方法在一定程度上逆转[3]。

滑膜成纤维细胞（Fibroblast synoviocytes, FLS）是关节滑膜的主要基质细胞，在生理状态下，它是一到两个细胞层，并且通过分泌关节滑液和蛋白聚糖等形成润滑和稳定关节的作用[4]。但是在病理状态下，FLS模拟癌细胞的增殖和迁移行为分泌大量炎症因子、活化其它炎症细胞，是类风湿关节炎的重要效应细胞，也是类风湿关节炎治疗的热门靶点[5-6]。甘草养阴汤（Gancao Nourish Yin Decoction, GCNY）是我院依据中医理论开发的一款药食同源配方（发明专利号：2019108435199、2021105153361），前期采用GCNY 药物血清体外干预培养的原代FLS，证实GCNY 可抑制FLS 的增殖、迁移活性，提示对类风湿关节炎的潜在治疗作用[7]。近年来，我们采用GCNY 直接体外干预MH7A（MIYAZAWA K 等[8]建立的一种永生化人类风湿性FLS）时偶然间发现，GCNY 对于老化的MH7A显示出促进其活性的作用。这显示出GCNY 对FLS在对数增长期及细胞老化状态下的不同调节作用。

为了进一步研究GCNY 对于改善细胞衰老的作用机制，本研究对老化的FLS 在GCNY 干预后进行转录组测序分析，为GCNY的进一步转化研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

3311 型细胞培养箱、ST40 型离心机、51119600C型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher 公司）；滤菌器（直径0.22 μm，德国Merck 公司）；BD FACSCanto II 型流式细胞仪（美国Becton Dickinson 公司）；Novaseq 6000 型二代测序仪（美国Illumina 公司）；DM IL LED型显微镜 （德国Leica 公司）。

DMEM（高糖）培养基（货号：C11995500BT）、胎牛血清（货号：10099）、TRIzol（货号：15596026）、双抗（青霉素-链霉素溶液，货号：SV30010）均购自美国ThermoFisher 公司。胰酶（货号：R001100）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，货号：D8537）均购自Sigma-Aldrich 公司；CCK-8 检测试剂（货号：CK-04，日本Molecular Technology 公司）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（货号：C1062S，上海碧云天公司）；甘草养阴汤（专利号：201910843519.9，自制）。

1.2 MH7A 细胞培养

MH7A 细胞购自广州吉尼欧生物科技有限公司，为第4 代，按照厂家说明书对细胞进行复苏、传代。培养条件：加入含质量分数分别为12%胎牛血清、1%双抗的DMEM（高糖）培养基于37 ℃、5% CO2孵育箱中培养。每次传代，以PBS 洗涤2 ～ 3 次、弃除未贴壁细胞，用质量浓度为2.5 g/mL 胰酶的消化液消化30 ～ 60 s，收集细胞进行传代。倒置显微镜下观察细胞生长速度，及时对细胞进行换液。

1.3 药物制备及实验分组

GCNY中药饮片配方组成及比例为m甘草∶m人参∶m干姜∶m蒲公英∶m罗汉果∶m玉竹∶m大枣= 4 ∶3 ∶2 ∶2 ∶4 ∶3 ∶4。将中药饮片加入适量蒸馏水进行反复煎煮3 h，并浓缩、过滤去除药渣。加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）调整浓度至质量分数为100 mg/mL，采用滤菌器（直径0.22 μm）过滤2 次，加入1%双抗，-20 ℃保存备用。CCK-8 实验时，采用MH7A细胞培养基稀释GCNY 至25 和50 μg/mL。对照组以培养基稀释等体积PBS，GCNY 浓度为0。

1.4 CCK-8 实验

对第12代衰老MH7A胰酶消化后，加入96孔板，每孔3×104个细胞。培养24 h 后细胞贴壁。轻柔吸取培养基，更换为含有不同浓度（0、25、50μg/mL）GCNY 培养基进行培养。在培养24、48 和72 h 时加入CCK-8 检测试剂，全波长酶标仪于波长490 nm 处检测每个实验孔的OD。实验重复3 次。每次实验每组5 个生物学重复。

1.5 细胞凋亡实验

将第12 代衰老MH7A 胰酶消化后，调整细胞悬液浓度为106/ mL，加入6孔板，每孔加入2 mL。37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱孵育24 h后贴壁、弃上清。以含终浓度为GCNY 0 和50μg/mL 的培养基继续培养48 h 后，收集2 组的每孔细胞。按Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作细胞，用流式细胞仪进行检测，计算细胞凋亡率，其中，Q2 期为早期凋亡细胞，Q4 为晚期凋亡细胞。实验重复3 次。每次实验每组3 个生物学重复。

1.6 转录组学二代测序及数据分析

细胞处理方式同“1.4”。将对照组（0）和GCNY组（50μg/mL）的MH7A 收集至EP 管，加入1 mL TRIzol®提取总RNA。RNA 高通量测序由武汉康测科技有限公司进行。将2μg 总RNA 用于测序文库制备。使用 Novaseq 6000 测序仪、PE150 模型对对应于200 ～ 500 bps 的PCR 产物进行富集、定量和测序。原始测序数据由Trimmomatic（v. 0.36）过滤，丢弃低质量读数、修剪被接头序列污染的读数。使用STRA软件（v. 2.5.3a）进行测序数据的预处理，参照基因组为UCSC 人类基因组参考联盟（Genome Reference Consortium Human Genome Build 38，GRCH38）(https://genome.ucsc.edu/)。通过特征计数（Subread-1.5.1；Bioconductor）计算映射到每个基因外显子区域的读数，然后使用edgeR 包对读数进行归一化处理，计算CPM 值（counts per million)并对数据取log2 值。数据质控箱图、DEG 火山图使用R 软件中的ggplot2包（v.3.3.3）作图。使用R 软件（v.3.6.3）中DESeq2包（1.26.0 版）鉴定两组之间的差异基因（DEG）。P＜0.05 及差异倍数（FC）大于1.5 认为有统计学意义。使用clusterProfiler 包（v.4.1.1）对DEG 进行基因GO 功能富集，P＜0.05 通路具有显著性。DEG热图使用R 软件中的pheatmap 包（v.1.0.12）作图。

1.7 统计学方法

用Graphpad prism 7 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 衰老MH7A 细胞培养

MH7A 细胞在对数生长期，约3 ～ 4 d 可传一代。在传代到10 代以后，增殖速度明显下降。在12 代以后衰老的细胞，增殖速度放缓，约8 ～ 10 d 可传一代。在16 代以后的MH7A 细胞，生长速度极度缓慢，无法培养成功。衰老细胞呈现衰老特征的高亮反射的细胞比例增多，见图1。

2.2 GCNY 促进老化MH7A 增殖活性

通过CCK-8 实验显示，GCNY 促进MH7A 细胞增殖活性。相对于对照组（0μg/mL），在干预48 h 时，GCNY（50μg/mL）的OD值明显高于对照组（P<0.05）；干预72 h 时，GCNY（50μg/mL）OD值明显高于对照组和低浓度组（25 μg/mL）（P＜0.05）。GCNY 呈一定剂量依赖性（25 和50 μg/mL）在48 ～72 h 促进老化MH7A 细胞增殖，见图2。

2.3 GCNY 抑制老化MH7A 凋亡

经流式细胞仪检测，发现GCNY（50 μg/mL）相对于对照组可明显下降衰老MH7A 早期凋亡细胞（Q2）比例，显示出对老化MH7A 凋亡水平的抑制作用，见图3。

2.4 转录组学研究

2.4.1 GCNY 对衰老MH7A 转录组的影响及DEGs 富集通路 对原始数据质量控制，送检样本的基因表达量一致，数据质量可靠，见图4A。转录组学研究显示GCNY 使衰老MH7A 显著上调基因127 个，下调基因101 个，见图4B。

上调基因主要富集于肌肉收缩（muscle contraction）、肌动蛋白介导的细胞收缩（actin-mediated cell contraction）、腺苷酸环化酶激活G 蛋白偶联受体信号通路（adenylate cyclase-activating G proteincoupled receptor signaling pathway）、cAMP 介 导 的 信号传导（cAMP-mediated signaling），肌动蛋白细胞骨架（actin cytoskeleton）、微丝运动活动（microfilament motor activity）和电压门控通道活动（voltage-gated channel activity）等通路，见图5A。下调基因主要富集于调节血管平滑肌细胞分化（regulation of vascular smooth muscle cell differentiation）、皮质细胞骨架组织（cortical cytoskeleton organization）、细胞皮层（cell cortex）、含胶原蛋白的细胞外基质（collagen-containing extracellular matrix）、DNA-结合转录激活因子活性RNA 聚 合 酶II- 特 异 性（DNA-binding transcription activator activity RNA polymerase II-specific）、 成 纤维细胞生长因子受体结合（fibroblast growth factor receptor binding）等通路，见图5B。

2.4.2 基于转录组学的最显著DEG 通过转录组学测序研究显示，最显著上调的mRNA 包括肌球蛋白重链13（MYH13）、BRCA1 关联的ATM 激活器1（BRAT1）、Gem 相 关 蛋 白7（GEMIN7）、RELB 原癌 基 因（RELB）、NF-KB 亚 基（NF-KB Subunit）、RNA-7SK 小核假基因（255RN7SKP255）、超极化激活环核苷酸门控钾通道3（HCN3）、RN7SK 假基因203（RN7SKP203）、和原肌球蛋白3 假基因8（TPM3P8）等（见图6A、B）。最显著下调的mRNA 包括赖氨酸乙酰转移酶2B（KAT2B）、含有WD 重复序列的蛋白质63（WDR63）、TTK 蛋白激酶（TTK）、具有序列相似性 101 的家族-成员A（Member AFAM101A）、锌指蛋白883（ZNF883）、双皮质素样激酶1（DCLK1）、IL-33 等（见图6A、C）。

3 讨论

GCNY 配伍中，甘草益气补中、清热解毒为君药；人参补气生津，玉竹养阴润燥，协调甘草作用，并消除其水钠潴留的副作用，为臣药。蒲公英、罗汉果清热解毒，干姜温中散寒，回阳通脉，属于佐药；大枣养血安神、缓和药性为使药。整个配方阴阳调和、滋阴为主，阴中求阳；对机体的阴阳失调形成了“缓冲液”样的作用。在本次研究中，我们偶然发现GCNY 对衰老的FLS（MH7A）生物学功能显示出促进细胞增殖活力与之前对数生长期的FLS 所阐述的抑制作用不同[7]。这一发现使得我们对于GCNY 对衰老MH7A 的影响产生了兴趣。流式细胞技术进一步证实，GCNY 对于衰老MH7A 早期凋亡的抑制作用。细胞的增殖活力是细胞状态的重要标志，衰老细胞的细胞周期停滞、增殖活性下降[9]。细胞衰老是机体衰老的机制之一，其相关基因也是老年相关疾病的致病基因[10]。

基于转录组学的研究，我们发现GCNY 上调了衰 老MH7A 的MYH13、BRAT1、GEMIN7、RELB、RN7SKP255、HCN3、RN7SKP203 和TPM3P8 等127个基因的表达水平。在例举的这些最显著DEG 中，RN7SKP255、RN7SKP203 和TPM3P8 目前被认定为伪基因，RELB 基因在功能方面的研究显示出促进细胞增殖的癌基因（生长基因）特点，并参与炎症反应的机制。近来研究显示HCN3 促进神经母细胞瘤细胞增殖，抑制其凋亡[11]。BRAT1 编码的蛋白质与肿瘤抑制蛋白BRCA1 及ATM 蛋白（细胞周期检查点信号通路的主控制器）相互作用，是应对电离辐射等导致DNA 损伤作出反应的重要基因[12]。MYH13 还显示通过调控FOXP2 基因网络调控神经发育和退行性变[13]。GEMIN7 是运动神经元存活（survival of motor neurons，SMN）复合物的蛋白成分，直接与SMN 和GEMIN6 相互作用，参与神经系统的重要功能[14]。

GCNY 对于衰老导致抑制细胞活性的相关基因具有抑制作用。例如在下调的101 个显著DEG 中，以KAT2B、WDR63、TTK、FAM101A、ZNF883、DCLK1、IL33 等最为显著。KAT2B 参与细胞的生长和分化，对于KAT2B 乙酰化的研究显示，该靶点可抑制中心体扩增[15]。WDR63 显示出促进下游p53 表达，同样扮演抑癌基因的角色[16]，并且p53 也是重要的衰老基因[17]。TTK 编码的蛋白是一种关键的有丝分裂检查点蛋白，在癌症的研究中体现出抑制细胞增殖的作用[18]。FAM101A 的主要功能是参与肌动蛋白丝束形成，但在骨和软骨的形成中起负性调节[19]。ZNF883 在肺癌的研究中被认为是癌症高甲基化1（HIC1）的下游基因，该通路负性调节肺癌细胞增殖，与预后负相关[20]。另外GCNY 在衰老的MH7A细胞中仍然显示抑制炎症因子的功效，如IL33 是IL-1 家族的成员，可激活TH2 细胞、肥大细胞、TH1 细胞、CD8+T 细胞和自然杀伤（NK）细胞等多种炎症细胞[21]。这些靶点的下调支持GCNY 增强衰老细胞的活力、抑制炎症方面的作用。另外下调的DCLK1 在癌症干细胞中的表现出多种生物学过程，是原癌基因范畴[22]，提示GCNY 对相关癌症耐药、转移的潜在价值，相关机理需要进一步研究。

4 结论

本研究证明GCNY 对衰老的MH7A 细胞表现出促进细胞增殖活力、抑制早期凋亡的作用，对于衰老细胞结构、功能、代谢层面的调整作用。基于MH7A良好的成纤维细胞特征，结果提示GCNY 在增强衰老细胞活力的潜在运用价值。课题组前期研究结果显示GCNY 能够抑制对数生长期的滑膜成纤维细胞增殖和促进其凋亡，说明GCNY 可能对不同状态下的细胞活力产生双向作用。本次研究也为进一步相关探索提供了可靠的靶点，相关生理作用效果需进一步验证。