基于网络药理学及分子对接探讨骨松宝颗粒治疗骨质疏松的机制

王相安，张 匀，王慧铭

（1.浙江大学医学院附属第一医院 营养科，浙江 杭州 310003；2.浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州 310053）

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种常见的全身代谢性骨病，以钙化的骨组织减少，骨组织微结构破坏及易并发脆性骨折为特征，有数据显示，我国65 岁以上人群OP 患病率高达32%，其中以女性居多[1]。目前西医治疗OP，主要是双膦酸盐、降钙素、甲状旁腺素、雌激素等药物，但存在毒副作用大及较高经济成本等缺点[2]。有研究表明，长期服用雌激素类药物会增加乳腺癌、子宫内膜癌的患病率，而长期服用双磷酸盐类药物会导致颌骨坏死[3-4]。

中医学将OP 归为“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范畴，发病与肾精亏虚、气滞血瘀关系密切，治疗当以活血化瘀、补肾健骨为主[5]。骨松宝颗粒是由淫羊藿、续断、地黄、三棱、莪术、知母、牡蛎、赤芍、川芎等组成的中药制剂，诸药配伍，起到补肾活血、强筋壮骨之功效，被广泛应用于OP 的治疗中并取得良好的临床疗效[6-7]。但由于组方复杂及现有研究方法的局限性，骨松宝颗粒治疗OP的药效机制尚未明确。

网络药理学基于系统生物学的理论，通过大量网络数据库资源，对作用的靶点进行预测，从微观药理调控基因表达的角度阐释药物多途径、多靶点治疗疾病的机理，符合中医“整体观”理论[8]。本研究基于网络药理学对骨松宝颗粒的主要活性成分、作用靶点、基因通路等方面进行分析，并通过分子对接方法验证活性成分与靶点的结合能力, 从而为其治疗OP 的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

TCMSP 数据库（http://tcmspw.com），Gene Cards 数据库（https://www.genecards.org），TCMID 数据库（http://www.megabionet.org/tcmid），OMIM 数据库（http://www.omim.org），ETCM 数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM），UniProt 数 据 库（https://www.uniprot.org），STRING 数据库（https://cn.string-db.org），Metascape 数据库（https://metascape.org），PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov），PDB 数据库（https://www.rcsb.org），Venny 2.1.0在线软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），Cytosape 3.7.2 软件，AutoDock Vina 1.1.2 软件，Chem3D软件，PYMOL2.3.0 软件。

1.2 方法

1.2.1 中药活性成分及作用靶点的筛选 通过TCMSP 数据库，检索淫羊藿、续断、三棱、莪术、知母、赤芍、川芎的活性成分。由于地黄根据炮制方法不同，分为鲜地黄、生地黄和熟地黄，但TCMSP中只有熟地黄的条目，故通过TCMID 及ETCM 数据库并结合中国知网、PubMed 等数据库查阅相关文献以补充地黄的活性成分[9]。由于TCMSP 中没有牡蛎的条目，故通过中药与化学成分数据库检索牡蛎，根据CAS 号在Pubchem 数据库找到化合物，最后根据口服利用度OB ≥30%且类药性DL ≥0.18 为条件对上述所有化合物进行筛选，以获取主要的活性成分并导入TCMSP 中，检索与之对应的靶点，同时利用UniProt 数据库，限定物种为“homo sapiens”，校准靶点的基因信息，得到标准化的靶点名称。

1.2.2 “中药-活性成分-靶点”网络的构建 利用筛选出的活性成分和靶基因在Cytoscape3.7.2 上绘制“中药-活性成分-靶点”网络图，运行Network Analyzer 插件进行拓扑分析，根据degree 值大小筛选出核心成分。

1.2.3 疾病相关靶点的筛选 利用Gene Cards 数据库（Relevance Score ≥1.0）和OMIM 数据库，以“osteoporosis”作为检索词进行检索，合并去除重复值后，最终获得骨质疏松的靶点。

1.2.4 “药物-疾病”共同靶点的筛选 将骨松宝颗粒的靶点与骨质疏松的靶点取交集，并利用Venny 2.1.0在线软件绘制Venn 图，得到“药物-疾病”共靶基因。

1.2.5 PPI 网络的构建 将“1.2.4” 项下获得的交集靶点导入STRING 数据库中，限定物种为“homo sapiens”，并以置信度≥0.4 为条件筛选，获取蛋白相互作用关系，得到“TSV”格式文件，并导入Cytosape 3.7.2 中，运行CytoNCA 插件进行拓扑分析，根据中心性（DC）、介度中心性（BC）、接近中心性（CC）等参数筛选出核心靶基因。

1.2.6 通路和功能富集分析 将“1.2.4”项下获得的交集靶点导入Metascape 平台，将生物种类设定为“homo sapiens”，根据P< 0.01，进行GO 富集分析与KEGG 通路分析，并利用R 语言可视化。

1.2.7 分子对接验证 在PubChem 数据库获得核心活性成分的2D 结构，导入Chem3D 优化后获得“MOL2”格式的3D 结构，同时利用AutoDock 4.2.6 加氢、分配电荷及设置可旋转柔性键后保存为“pdbqt”文件。在PDB 数据库寻找靶蛋白的3D 结构，导入PYMOL 2.3.0 中对其去除水分子及配体后，再利用AutoDock 4.2.6 加氢、分配电荷后保存为“pdbqt”文件。最后，利用AutoDock Vina 1.1.2 将受体蛋白与配体小分子进行分子对接并用PYMOL2.3.0 可视化。

2 结果

2.1 中药的活性成分和作用靶点收集

通过检索及设定OB ≥30%且DL ≥0.18 为条件筛选并剔除没有相应靶点的活性成分后，共获取60 种活性成分，其中，淫羊藿20 种，川芎5 种，知母9 种，赤芍11 种，续断3 种，三棱3 种，地黄1种，莪术1 种，牡蛎2 种，以及5 种共有活性成分，利用UniProt 数据库校准所有靶点名称，去除重复及无效值后共得到266 个靶点。为方便后续研究，按药物的首字母缩写进行编码，其中赤芍活性成分被标记为CS1-CS11，以此类推，淫羊藿、川芎、地黄、牡蛎、续断、知母、莪术、三棱的活性成分分别被标记为YYH1-YYH20；CX1-CX5；DH1；ML1-ML2；XD1-XD3；ZM1-ZM9；ES1；SL1-SL3。5 种共有活性成分被标记为A1-E1。

2.2 “中药-活性成分-靶点”网络的构建

通过Cytoscape3.7.2 绘制“中药-活性成分-靶点”网络图，见图1。图中共含有335 个节点（9 个中药节点、60 个活性成分节点、266 个药物作用的靶点节点）和1 229 条边。通过内置的Network Analyzer分析该网络拓扑学参数，并根据degree 值大小选取排名前7 的核心成分，见表1。

表1 骨松宝颗粒的核心活性成分信息Tab.1 Information of core-components of Gusongbao granules

2.3 骨质疏松靶点的收集与韦恩图的构建

利用Gene Cards 数据（Relevance Score ≥1.0）库和OMIM 数据库，以“osteoporosis”为关键词，检索骨质疏松的靶点，并将两个数据库得到的靶点合并删除重复值后,共得到1 220 个靶点，与骨松宝颗粒相关的266 个靶点同时导入Venny 2.1.0 在线软件进行交集分析并绘制Venn 图，共获得88 个交集靶点，即为骨松宝颗粒治疗骨质疏松的潜在作用靶点，见图2。

2.4 PPI 网络的构建

将88 个交集靶点导入STRING 数据库，限定物种“Homo sapiens”，设置置信度≥0.4，剔除1 个无相互作用关系的蛋白后，得到由87 个节点及1 498条边组成的PPI 网络及“TSV”格式文件，见图3。将“TSV”格式文件导入Cytoscape3.7.2 软件中，运行CytoNCA 插件进行拓扑分析，计算出DC、CC及BC 的值。其中，DC 的中位数为32，CC 的中位数为0.61，BC 的中位数为28.18，第一轮筛选设为DC ≥32，CC ≥0.61，BC ≥28.18，共得到37 个靶点。第二轮筛选设为DC ≥49，CC ≥0.69，BC ≥74，共得到17 个靶点。最后设定DC ≥61，CC ≥0.76，BC≥178.18进行第3次筛选,最终得到8个核心靶点，即IL6、AKT1、TNF、VEGFA、IL1B、TP53、JUN、MMP9。

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 利用Metascape 平台，设置P< 0.01 作为筛选条件，将交集靶点进行GO 的生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）分析，总共富集到1 570 个条目，其中，1 419 项BP，105 项MF，46 项CC，根据−lgP 值筛选出排名前10 的条目，并利用R 语言绘制柱状图，见图4。其中，BP 主要涉及对激素、胰岛素及有机氮化合物的反应等；CC 主要涉及RNA 聚合酶II 转录调控、转录抑制因子等；MF 主要涉及信号受体激活因子活性、丝氨酸水解酶活性、内肽酶活力等。

2.5.2 KEGG 通路富集分析 利用Metascape 平台，设置P< 0.01 作为筛选条件，将交集靶点进行KEGG 分析，共得到187 条信号通路，根据−lgP 值筛选出排名前20 条目，并利用R 语言绘气泡图，见图5。主要涉及等MAPK、NF-kappa B、JAK-STAT及FoxO 等信号通路，同时，为了进一步探索排名前7 的活性成分及其靶点在疾病通路中发挥的作用，运用Cytoscape 3.7.2 构建“活性成分-靶点-通路”网络图，见图6。

2.6 分子对接结果

使用AutoDock Vina 1.1.2 对关键靶点和活性成分进行分子对接，结果见表2。结合能值越低，二者的结合效果越好，通常以结合能≤-5.0 kJ/mol 作为标准。结果显示，各靶点和活性成分之间对接的最低结合能结果均小于-5.0 kJ/mol，说明活性成分与受体蛋白具有较好的结合活性。其中，分子对接模式图见图7。

表2 核心活性成分和核心靶蛋白的结合能Tab. 2 Binding energy of core active ingredient and core target protein

3 讨论

本研究通过网络药理学方法筛选出骨松宝颗粒60 个潜在活性成分，其中，山柰酚、槲皮素、木犀草素、脱水淫羊藿素、芒柄花黄素等具有较高的度值，为骨松宝颗粒发挥作用的关键药效成分。有研究指出，槲皮素可抑制核因子κB 受体活化因子配体（RANKL）介导的破骨细胞生成、成骨细胞凋亡、氧化应激和炎症反应等诸多生物过程，同时刺激滋养血管及骨量的生成[10]。VAKILI S 等[11]通过大鼠体内实验发现槲皮素可以调节骨细胞的自噬和凋亡，从而预防骨质疏松。木犀草素可以抑制氧化应激反应，通过调节ERK/LRP-5/GSK-3β 信号通路促进成骨细胞的分化，从而减轻糖皮质激素诱导的骨质疏松[12]。ZHENG Z G 等[13]通过STZ 诱导的糖尿病小鼠模型发现脱水淫羊藿素作为SREBP2 抑制剂，可以抑制破骨细胞的形成而减少糖尿病诱发的骨量丢失。芒柄花素能够抑制原始骨髓单核-巨噬细胞向破骨细胞增殖和分化,并下调破骨细胞骨吸收功能相关蛋白和基因的表达[14]。JING Z 等[15]通过体外实验发现，山柰酚可以通过mTOR 信号通路促进成骨的生成。

通过蛋白互作网络分析得出，AKT1、JUN、TNF-α、IL-6、VEGFA、MMP-9 及IL-1B 等是骨松宝颗粒治疗骨质疏松的关键靶点。其中，IL-1B 可以刺激破骨细胞前体向成熟破骨细胞的增殖和分化，其基因变异与骨质疏松易感性密切相关[16]。VEGFA 即血管内皮生长因子A，可以强化骨髓间充质干细胞活性及抑制破骨细胞活性，从而提高骨密度[17]。IL-6、TNF-α 作为炎症因子能够参与骨吸收，并促进破骨细胞的形成与分化[18]。MMP-9 参与骨骼的发育及重塑，在破骨细胞分化期间MMP-9 表达增高，刺激骨吸收[19]。AKT1 作为PI3K-AKT 信号通路的关键因子，可以参与成骨细胞和破骨细胞协调的骨重建过程[20]。刺激JUN 表达可以增加骨祖细胞数量并诱导其不断增殖分化为成骨细胞，从而促进骨生长和愈合[21]。

KEGG 通路分析显示药物作用靶点主要富集于MAPK、NF-kappa B、JAK-STAT、IL-17 及FoxO 等信号通路。ZHI X 等[22]研究发现，通过抑制MAPK通路的磷酸化，可以降低CTR、MMP-9 和TRAP 的表达水平，从而抑制破骨细胞形成。YIN Z 等[23]进行体外实验发现，通过抑制NF-kappa B 通路，可以有效抑制破骨细胞成熟和骨吸收，保护骨小梁的结构。FOXOs 能调节骨细胞功能及其细胞间信号转导，进而控制骨量及影响骨骼发育[24]。JAK/STAT 通路可以通过IRF1 基因调控成骨细胞和破骨细胞的成熟和分化，参与机体的骨代谢过程[25]。IL-17 在多种炎症细胞中表达，可以通过增加RANKL 的分泌起到刺激破骨细胞分化、诱导骨量丢失的作用[26]。

4 结论

骨松宝颗粒中山柰酚、槲皮素、木犀草素、脱水淫羊藿素等潜在活性成分，通过MAPK、NF-kappa B、JAK-STAT 及FoxO 等关键信号通路，分别与AKT1、JUN、TNF、IL-6、VEGFA、MMP9 及IL-1B 等 核 心靶点以氢键方式结合，协同调控成骨细胞和破骨细胞的成熟和分化，刺激骨量形成，从而发挥治疗骨质疏松的作用。分子对接结果提示关键药效成分与关键靶蛋白均显示较好的结合能力，未来可进行相关的基础实验加以验证，以期为骨松宝颗粒的开发及应用提供新的启示。