五眼果水提物激活自噬预防小鼠肾结石形成的研究

杨 柯，李雨君，李森华，言娇霞，曾春晖

（广西中医药大学 药学院，广西 南宁530001）

肾结石是肾脏疾病中的常见病，其发病率和复发率高。它的形成是多种物理化学作用的复杂过程，包括结石成分在肾小管管腔内过饱和、成核、生长、聚集和滞留[1]。当肾小管上皮细胞受到损伤时可促进晶体在细胞表面粘附， 粘附晶体的数量逐渐增多、聚集并形成肾结石[2]，因此，减轻肾小管上皮细胞损伤是防止肾结石形成的关键。近年研究表明， 自噬与肾结石的形成密切相关，自噬是真核细胞具有的一种保护和防御机制，能降解细胞内有害物质对肾小管上皮细胞的损害，维持细胞内环境的稳态，调控自噬可能是预防肾结石的一个潜在靶点[3-6]。

目前西医治疗肾结石常以手术治疗为主要手段，手术治疗常用的方法有体外冲击波碎石术（ESWL）、输尿管肾镜取石术（TUL）、经皮肾镜取石术（PCNL）和开放性手术等，但手术治疗存在费用昂贵、复发率高等问题，中医应用中草药治疗肾结石历史悠久且疗效良好，因而国内外研究者对中草药治疗肾结石的研究成了该领域的热点之一[7-8]。

五眼果是漆树科植物南酸枣Choerospondias axillaris（Roxb.）Burtt et Hill 的干燥果实，其药用名为 “广枣”，主要分布于西藏、云南、贵州、广西、广 东等地，具有抗氧化和增强免疫等药理活性[9-10]。民间使用五眼果治疗泌尿系统结石具有良好效果。本课题组前期研究发现五眼果具有抗草酸钙结石和抗氧化损伤作用[11-12]。本实验旨在研究五眼果水提物是否通过介导自噬、减轻肾损伤而影响草酸钙结石形成，为五眼果进一步开发利用提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级KM 小鼠，雄性，体质量为18 ～ 22 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证：SCXK（湘）2019-0004，动物使用许可证：SYXK（桂）2019-0001。

1.2 药物与试剂

五眼果由广西中医药大学郭敏副教授鉴定为漆树科植物南酸枣Choerospondias axillaris(Roxb.) Burtt et Hill 的干燥果实；枸橼酸钾（批号：20190815，国药集团化学试剂有限公司）；乙醛酸（批号：XACPHTE，梯希爱上海化成工业发展有限公司）；全蛋白提取试剂盒（批号：20210419，江苏凯基生物技术股份有限公司）；BCA 蛋白质试剂盒（批号：16E25C46，博士德生物工程有限公司）；彩虹蛋白Marker（批号：01057501，美国Thermo Fisher）；GAPDH 抗 体（ 批 号：GR217575-64，Abcam）；辣根酶标记山羊抗兔IgG 抗体（批号：20000174，Proteintech Group）；KIM-1 抗 体（ 批 号：A2831，ABclonal）；LC3B 抗 体（ 批 号：2755S）、p62 抗 体（批号：39749S）、Beclin-1 抗体（批号：3738S）均购于Cell Signaling Technology；Ca2+试剂盒（批号：20210720）、Cr 试剂盒（批号：20210708）、BUN 试剂盒（批号：20210707）均购于南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器

ME204E 型电子天平［梅特勒-托利多科技（中国）有限公司］；Synergy H1 型酶标仪（美国博腾仪器有限公司）；RS36 型全自动染色机（常州派斯杰医疗设备有限公司）；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威电子仪器有限公司）。

2 方法

2.1 五眼果水提物制备方法

取2 kg 药材粗粉，加入12 L 蒸馏水，浸泡30 min，加热提取2 h，过滤，取滤液；将10 L 蒸馏水加入药渣中，加热提取1 h，过滤，取滤液；合并两次滤液，所得溶液浓缩至0.4 kg，即得实验受试物五眼果水提物，实验时配制成所需剂量。

2.2 动物分组、给药及造模

60 只雄性KM 小鼠随机分为六组，即正常组、模型组、阳性组（枸橼酸钾，1.75 g/kg），五眼果高、中、低剂量组（40、20、10 g 生药/kg），每组10 只。各给药组动物按20 mL/kg 灌胃给予相应药物，正常组和模型组灌胃给予等量生理盐水，连续30 d。于第21 天开始，除正常组外其余各组参考YANG B 等[13]的方法稍加改进造模，即连续腹腔注射乙醛酸（10 mg/mL）10 d，诱导肾结石模型。

2.3 尿生化指标检测

于第30 天灌胃后，将各组小鼠置于自制小鼠代谢笼收集24 h 尿液，采用铬酸钾氧化甲基红催化光度法检测小鼠尿液中Ox 含量；采用微板法检测小鼠尿液中Ca2+含量。

2.4 血生化指标检测

收集小鼠尿液后，采集血液，分离血清，分别采用微板法、肌氨酸氧化酶法、脲酶法检测血清中Ca2+、肌酐、尿素氮含量。

2.5 肾组织病理形态学检查

剖取小鼠左肾，置于4%多聚甲醛中固定，48 h后脱水、包埋、切片，进行HE 染色，光学显微镜下观察肾脏的病理学改变和结晶沉积。

2.6 Western blot 法检测小鼠肾组织Beclin-1、LC3B、P62 和KIM-1 蛋白表达

RIPA 裂解液中加入PMSF（100 ∶1）从肾组织中提取蛋白质，并用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白质样品等量（40 μg）进行实验，用15% SDS-PAGE 分离，然后转移到甲醇活化的PVDF 膜上。在室温下用1x 无蛋白快速封闭液中封闭30 min 后，放置相应的抗体4℃孵育过夜。TBST 清洗后，在室温下将膜置于二抗中孵育2 h。用TBST 清洗膜后，与ECL 底物试剂盒反应，后置于凝胶成像仪中发光显色，保存图片。使用Image Lab 软件测量目标蛋白，然后根据公式：蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参灰度值，分析各组目的蛋白的表达量。

2.7 统计学方法

用SPSS 22.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。以P＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 对小鼠尿液和血清生化指标的影响

与正常组相比，模型组小鼠的尿Ca2+水平升高（P＜0.05），尿草酸水平降低（P＜ 0.05），血清Ca2+水平降低（P＜ 0.05），肌酐和尿素氮水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，阳性组和五眼果各剂量组小鼠的尿Ca2+水平降低（P＜ 0.05），阳性组和五眼果高剂量组小鼠尿草酸水平升高（P＜ 0.05），五眼果低剂量组小鼠血清Ca2+水平升高（P＜ 0.05），五眼果高剂量组小鼠血清尿素氮和肌酐水平降低（P＜0.05），结果见表1。

表1 对小鼠尿液和血清生化指标的影响（±s，n = 10）Tab. 1 Effects on biochemical indexes of urine and serum in mice（±s，n = 10）

表1 对小鼠尿液和血清生化指标的影响（±s，n = 10）Tab. 1 Effects on biochemical indexes of urine and serum in mice（±s，n = 10）

注：模型组与正常组比较，#P ＜ 0.05；各给药组与模型组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

组别 剂量/（g/kg） 尿液 血清Ox/（µmol/L） Ca2+/（mmol/L） Cr/（µmol/L） BUN/（mmol/L） Ca2+/（mmol/L）正常组 - 14.54±2.05 0.83±0.42 27.28±2.55 13.87±2.90 1.34±0.04模型组 - 12.46±1.75# 2.12±1.03# 34.37±6.93# 18.99±2.43# 1.29±0.05#阳性组 1.75 16.20±2.42* 1.02±0.28* 31.05±6.06 18.42±3.04 1.27±0.02五眼果高剂量组 40 15.12±2.96* 0.98±0.31* 25.30±5.65** 16.32±1.67* 1.29±0.04五眼果中剂量组 20 12.51±2.89 0.78±0.38* 29.77±8.77 18.26±2.30 1.33±0.08五眼果低剂量组 10 11.55±4.01 1.06±0.31* 26.89±5.54* 17.49±4.10 1.39±0.05*F-2.855 6.918 2.559 2.946 6.410 P-0.026 0.000 0.038 0.022 0.000

3.2 对小鼠肾组织病理学的影响

与正常组相比，模型组小鼠肾小管出现明显扩张，甚至变性坏死，纤维组织增生和结晶沉积明显增加，并堵塞在肾小管或集合管管腔。五眼果高剂量可明显减轻上述病理学改变，结果见图1。

3.3 对小鼠肾组织Beclin-1、LC3B、P62 和KIM-1蛋白表达的影响

与正常组相比，模型小鼠LC3BII/LC3BI 表达水平明显降低（P＜ 0.05），肾小管损伤分子KIM-1 表达水平明显升高（P＜ 0.05）；与模型组相比，五眼果各剂量均能升高LC3BII/LC3BI 表达水平（P＜ 0.05），对P62、Beclin-1 无明显影响（P＞ 0.05），五眼果高剂量可降低KIM-1表达水平（P＜0.05），结果见图2。

4 讨论

临床上80%以上的肾结石类型属于草酸钙结石[14]，治疗后1 年、5 年和10 年复发率分别为16%、32%和53%[15]。因此，对患者进行预防是减少肾结石形成的重要手段。2007 年有研究者首次使用乙醛酸腹腔注射小鼠，成功构建草酸钙肾结石小鼠模型，乙醛酸是草酸的前体物质，经小鼠腹腔吸收进入血液循环，在小鼠肝脏内经乙醛酸氧化酶作用下合成草酸，导致小鼠体内草酸水平升高，过量的草酸与体内钙离子相互结合后可形成草酸钙结晶[16-18]。此后该造模方法被研究者广泛采用[19-20]。因此，采用腹腔注射乙醛酸的造模方法，构建小鼠草酸钙结石模型进行实验。高草酸尿和高钙尿是草酸钙结石形成的必备条件[21]。由上述可知乙醛酸在酶的作用下合成草酸，导致小鼠体内草酸水平升高。尿液结果显示，模型组小鼠尿草酸明显低于正常组，可能是因为来源于乙醛酸分解的草酸与体内Ca2+结合形成草酸钙结石导致的。阳性组小鼠经枸橼酸钾处理后，促进尿草酸的排泄，但尿中Ca2+含量较低，从而阻碍结石形成，与YANG B等[13,22]的研究结果一致。五眼果高剂量对尿液中草酸和Ca2+水平的影响与阳性组一致，表明五眼果水提物可促进草酸经尿液排出体外，同时，增加尿液中Ca2+重吸收，使尿中草酸钙结石形成缺乏物质基础，从而阻碍结石的形成。肌酐和尿素氮是反映肾功能的2 个重要指标，当肌酐和尿素氮水平升高时，表明肾脏受损。因此，我们通过检测血清肌酐和尿素氮来评价肾功能。乙醛酸诱导小鼠后，模型组小鼠血清肌酐和尿素氮升高，表明肾脏已发生损伤，而五眼果高剂量可降低血清肌酐和尿素氮水平。草酸钙可诱导肾小管损伤的特异性标志物KIM-1 水平升高，肾损伤后为晶体粘附和肾脏内晶体沉积提供了场所，促进结石的形成[23-24]。本实验研究中，模型组小鼠KIM-1 表达水平升高，而五眼果高剂量组小鼠KIM-1 表达水平降低。此外，HE 染色结果显示，模型组小鼠肾损伤和结石明显增加，五眼果高剂量可明显减轻上述病理学改变。血清肌酐、尿素氮、肾损伤分子KIM-1以及HE 染色切片指标相互验证，表明五眼果水提物减轻了肾脏损伤，并可能在预防肾结石引起的肾损伤中发挥作用。

自噬在维持细胞内环境稳定和功能起着重要的作用[25]，在异常的情况下，自噬可清除细胞内受损的大分子和细胞器来维持细胞内环境的稳定，从而保护细胞免受损伤[26]。近年研究表明激活自噬可保护肾小管上皮细胞免受损伤[27]。当自噬被激活时，Beclin1 表达水平升高，聚集形成Beclin1-PIK3C3-PIK3R4 复合物，从而触发自噬蛋白级联反应，启动自噬体形成[28]，LC3-I 被切割成LC3-II，标志着自噬体的形成，通过与溶酶体融合实现蛋白质的降解[29]。P62 降解是自噬通量激活的标志，它通过直接结合LC3选择性地并入自噬体，并通过自噬溶酶体降解[30]。五眼果水提物促进LC3BII/LC3BI 表达水平，表明五眼果水提物可激活自噬。

5 结论

本次实验采用腹腔注射乙醛酸的造模方法成功构建小鼠草酸钙结石模型，初步探讨了五眼果水提物对草酸钙结石小鼠的预防作用是否通过介导自噬而影响草酸钙结石形成。研究证实五眼果水提物可通过激活自噬减轻乙醛酸所诱导的肾损伤，同时降低尿钙水平，促进尿草酸排泄，从而对草酸钙结石的形成有良好预防作用。明确了五眼果水提物可通过调控自噬而发挥预防草酸钙结石形成的作用。至于五眼果的有效成分如何调控自噬发生有待进一步研究。