改良激光镭射孵化术对冻融胚胎移植周期复苏率及妊娠结局的影响*

吴成亮 苏占营 江旺航 辜敏

在经济生活水平提高的同时不孕不育发生率逐渐升高，为满足患者生育需求，辅助生殖技术日益精进[1]，顺利妊娠常需要多个周期完成，因此保有多个胚胎方便多次完成，在第一个周期移植完成后剩余的胚胎需进行冷冻保存[2]，而胚胎经过冷冻和解冻之后，其周围的透明带硬度上升，不利于着床[3]，因此需要进行辅助孵化。辅助孵化是以人工干预的方式帮助胚胎从透明带中孵出、在子宫着床[4-5]，其方法多样，有化学法、机械切割法、激光法[6]，其中激光辅助孵化因其快速、定位准确而在临床广泛应用[7]。传统激光法采用1 480 nm 的激光光束将透明带削薄或打小孔辅助孵化，采用削薄的方式能明显薄化透明带外层结构[8]，但难以改变其内层组织，而采用打孔的方式则难以获得理想的透明带宽度，不利于胚胎植入，或可造成胚胎嵌顿、双胎等情况发生，增加试管婴儿风险[9]。因此本研究在传统激光镭射孵化术的基础上进行改良，使激光能量精准地聚焦在透明带上并打洞，扩大透明带激光打孔面积，产生出理想大小的洞口，从而提高胚胎发育潜能，帮助胚胎孵出着床，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020 年1-12 月在九江市妇幼保健院生殖医学中心施行冷冻胚胎复苏移植周期移植的184 例不孕女性。纳入标准：（1）年龄≥18 岁；（2）不孕时间≥1 年，符合文献[10]《不孕症诊断指南》中的诊断标准。排除标准：（1）存在家族遗传病；（2）生殖系统发育不全或畸形；（3）严重精神疾病，无法配合。按单双数法分为改良组（n=92）和传统组（n=92）。本研究经医院伦理委员会批准，入组人员签署研究知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 促排-取卵-取精-体外受精-胚胎移植（1）促排：不孕女性口服药物等方式以控制性超排卵获得一定数量卵子。（2）取卵：行阴道超声介导下取卵术获得卵子。（3）取精：男方通过手淫或睾丸穿刺取精的方式获得精子。（4）体外受精及胚胎培养：使用体外受精-胚胎移植技术体外受精；使用瑞士Vitrolife 辅助生殖培养液进行体外胚胎培养。根据Gardner 评分标准将囊胚分期[11]。（5）胚胎移植：胚胎体外的发育天数第3 天（D3）选择1～2 枚胚胎进行移植，剩余的胚胎经不孕女性及其配偶许可后冷冻保存或继续培养至发育天数第5 天（D5）或第6 天（D6）形成囊胚后冷冻保存。

子宫内膜准备，（1）自然周期：月经≥10 d，卵泡直径≥14 mm，子宫内膜≥7 mm，排卵第5 天进行冻融囊胚移植；（2）激素替代周期：月经第3 天起口服雌激素，15 d 后超声检测子宫内膜≥7 mm，注射孕激素，6 d 后进行冻融囊胚移植。

1.2.2 胚胎冷冻保存 激光法人工皱缩胚胎，基本完全皱缩后采用日本加藤VT101 玻璃化冷冻试剂盒行玻璃化冷冻；室温转移胚胎至平衡液，根据胚胎发育时期平衡3～8 min，后续将胚胎转移至玻璃化液并在60 s 内装载至日本加藤Cryotop 冷冻载杆然后液氮冷冻。

1.2.3 冷冻胚胎解冻复苏 采用日本加藤VT102 玻璃化解冻试剂盒复苏胚胎：37 ℃水浴解冻液，冷冻胚胎的载杆依次投入解冻液WS1、2、3、4 中停留1、3、5、5 min，然后转入瑞典Vitrolife 系列囊胚培养液G2 培养；解冻胚胎以细胞数≥50%总细胞数为胚胎复苏标准。

1.2.4 改良激光镭射孵化 改良组胚胎从解冻液取出即行改良激光镭射孵化术：使用非接触式激光显微操作系统RI，将激光靶心对准卵周间隙宽处连续发射激光，以削除包含冷冻前激光皱缩时透明带开孔处25%的透明带、中心部位完全穿破透明带为目的，控制操作时间在60 s 内；后续使用瑞典Vitrolife 系列囊胚培养液G2 洗涤并移入囊胚培养液培养2～3 h 直至移植。移植后第1 天起给予孕激素黄体支持至第14 天验血人绒毛膜促性腺激素，以第28 天超声下可见孕囊为临床妊娠。

1.2.5 传统激光辅助孵化术 传统的激光法是指采用激光光束将透明带削薄或者打小孔，以起到辅助孵化的作用。

1.3 观察指标及判定标准（1）比较两组胚胎复苏率。D3 期胚胎卵裂球≥50% 存活，D5 及D6期囊胚、囊胚腔扩张，判定为复苏成功，胚胎复苏率=复苏成功胚胎数/ 移植胚胎总数×100%。（2）比较两组临床妊娠率。临床妊娠率=临床妊娠周期数/总周期数×100%。（3）比较两组胚胎植入率。胚胎植入率=超声可见孕囊数/移植胚胎总数×100%。（4）比较两组早期流产率，胚胎移植后12 周内胚胎发育停止判定为早期流产，早期流产率=早期流产周期数/总周期数×100%。（5）比较两组异位妊娠率，将孕囊着床于子宫外及子宫内外同时妊娠的妊娠判定为异位妊娠，异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠总周期数×100%。（6）比较两组活产率，活产率=活产分娩周期数/总周期数×100%。（7）比较两组胎儿生长发育情况，使用超声检查胎儿生长发育情况，记录畸形发生情况。

1.4 统计学处理 本研究所有资料采用SPSS 24.0软件包分析，其中计量资料以（）表示，两组比较用t 检验，三组比较用单因素方差分析；计数资料以（%）表示，比较用χ2检验或Fisher 精确检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 不同孵化术胚胎移植指标比较 改良组进行195 个周期，孵化胚胎共计336 枚，其中D3 期胚胎193 枚，108 个周期；D5 期囊胚102 枚，62 个周期；D6 期囊胚41 枚，25 个周期。对照组进行197 个周期，孵化胚胎共计349 枚，其中D3 期胚胎182 枚，103 个周期；D5 期囊胚120 枚，76 个周期；D6 期囊胚47 枚，18 个周期。两组胎儿均无生长发育异常。两组移植日内膜厚度、胚胎移植数量、内膜准备方案、移植胚胎发育阶段比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。改良组胚胎复苏率、胚胎植入率、临床妊娠率、活产率均高于传统组，早期流产率、异位妊娠率均低于传统组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2、3。

表2 不同孵化术移植日内膜厚度及胚胎移植数量比较（）

表2 不同孵化术移植日内膜厚度及胚胎移植数量比较（）

表3 不同孵化术基线资料及胚胎移植指标比较（%）

表3（续）

2.3 改良组不同胚龄胚胎移植指标比较 改良组D3 亚组、D5 亚组、D6 亚组移植日内膜厚度、胚胎移植数量、内膜准备方案比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。三组异位妊娠率均为0，三组胚胎复苏率均为100%。D3 亚组、D5 亚组、D6 亚组胚胎植入率、临床妊娠率、早期流产率、活产率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。D5 亚组胚胎植入率、临床妊娠率、活产率均高于D3 亚组，早期流产率低于D3 亚组，差异均有统计学意义（χ2=5.834、5.796、5.664、6.630，P<0.05）。D3、D6 两亚组所有胚胎移植指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表4、5。

表4 改良组移植日内膜厚度及胚胎移植数量比较（）

表4 改良组移植日内膜厚度及胚胎移植数量比较（）

表5 改良组不同胚龄基线资料及胚胎移植指标比较（%）

表5（续）

3 讨论

自1978 年世界首例试管婴儿在英国诞生，人类辅助生殖技术得到了空前发展[12]，到目前为止应用最为广泛的技术仍为体外受精-胚胎移植技术，此法通过取卵、取精、体外受精、胚胎培养、胚胎移植过程辅助生殖，成功率能够达到40%以上，但目前仍然存在较高的植入失败率，部分失败原因来自胚胎培养，但更多的原因集中于胚胎无法从透明带中孵出[13]。

透明带是以糖蛋白为主要成分，存在于卵母细胞及早期胚胎周围的组织，其具有保护卵子、保护胚胎的作用[14]，胚胎发育为囊胚后使得透明带破裂，然后在子宫着床[15]，然而在体外受精-胚胎移植周期中胚胎冻融会造成透明带糖蛋白发生变性，导致透明带硬化，影响胚胎的孵出[16]。激光辅助孵化技术是一种辅助胚胎从透明带膜中孵化的技术，具有操作简单、控制精确、安全可靠等优势[17]。有研究表示对卵裂期胚胎解冻后行激光辅助孵化可以显著提高冻融周期的临床妊娠率和冻融胚胎的植入率[18]，此外在Jwa 等[19]研究中显示激光辅助孵化技术具有较高安全性，不会提高先天畸形的风险。

激光辅助孵化技术采用对透明带进行薄化或者打小孔的方法，以提高胚胎的孵出和种植能力[20]。但是用激光削薄方法行辅助孵化仅将透明带外层结构薄化，内层结构仍然完整，并不能有效帮助胚胎孵出和种植，另外发现采用激光打小孔进行辅助孵化，透明带宽度不够不能提高种植率，而且宽度过小易导致胚胎嵌顿，易导致双胎，增加了试管婴儿双胎风险[21]。因此激光辅助孵化适宜深度和宽度对提高种植率和减低辅助生殖并发症是至关重要的[22]。本项课题研究将传统的激光辅助孵化进行改良，在解冻第二步立即行改良激光镭射孵化术，选取卵周间隙相对较大或碎片较多的区域，在非接触式激光显微操作系统下将激光对准透明带连续发射削除25%以上透明带中心完全穿破透明带。结果显示，改良组胚胎复苏率、临床妊娠率、胚胎植入率、活产率均高于传统组，早期流产率、异位妊娠率均低于传统组（P<0.05），分析是因为经改良激光镭射孵化术在进行孵化时，处理的范围更大，更符合胚胎着床的生理过程，同时切除透明带的部位更大，而且因为在细胞仍处于皱缩期时开始激光孵化，从而避免孵出中产生嵌顿，而且采用非接触式系统，可以避免因为直接接触透明带内细胞造成的热损伤。此外，本研究改良组根据胚胎在体外的发育天数分为D3 亚组、D5 亚组、D6 亚组比较其移植情况，D5 亚组胚胎植入率、临床妊娠率、活产率均高于D3 亚组，早期流产率低于D3 亚组，差异均有统计学意义（P<0.05）。D3、D6 两亚组所有胚胎移植指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。说明不同发育阶段的胚胎妊娠结局有所差异，D5 囊胚较发育早期胚胎能获得更好的妊娠结局，这提醒在有较多胚胎的患者中，应优先培养至囊胚冷冻以避免妊娠失败。

综上所述，改良激光镭射孵化术能有效辅助冻融胚胎孵化，提高其胚胎复苏率，有助于获得较好妊娠结局。