高效液相色谱指纹图谱结合化学计量学方法评价瑶药材网络鸡血藤根的质量

严赟，郭雯雯，林小娟，张赟赟，杨海船，王彩玉，黄莉（.广西中医药研究院，南宁 500；.广西食品药品检验所，南宁 500；.桂林医学院药学院，广西 桂林 54004）

网络鸡血藤根是豆科植物网络崖豆藤Millettia reticulataBenth.的干燥根，瑶族习用药材。《全国中草药汇编》《中国民族药志要》《中国瑶药学》《广西药用植物名录》等对其原植物、药用价值、地理分布等情况均有简要记述，其具有祛风除湿、通经活络、强筋骨、镇静的功效，用于治疗风湿筋骨痛、四肢麻木、腰膝酸痛、瘫痪、贫血、遗精、盗汗、月经不调、闭经、跌打损伤等病症，为多民族使用的民间草药[1-4]。目前尚无国家标准及地方标准对网络鸡血藤根药材进行质量控制和评价，近年来，广西打造特色健康医药产业，鼓励壮瑶药产业发展壮大，因此有必要全面地评价网络鸡血藤根的化学成分，建立能有效、全面控制该药材的质量标准。中药成分复杂，利用中药指纹图谱中的相似度分析评定各批次样品指纹图谱间的相似程度，描述它们各自化学组分的差异性和波动情况，能更全面地反映出药材的质量[5-8]。主成分分析是近年来中药指纹图谱结合数理统计方法形成的一种方法研究。中药为多成分物质且很多成分均未有研究报道，主成分分析是为了预测该中药可能的主要作用成分，对于该中药进行后期的物质基础研究、质量标准的建立以及药效药理等方面的研究具有指导意义[9-12]。本试验采用高效液相色谱法对10批网络鸡血藤根药材进行分析，建立HPLC指纹图谱进行相似度分析，并结合聚类分析和主成分分析，为不同产地的网络鸡血藤根质量评价提供理论依据和参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters2695-2998高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Milli-Q超纯水仪（德国默克）；XS205DU型电子天平（十万分之一，梅特勒-托利多仪器有限公司）；S120H超声仪（德国艾尔玛）。

1.2 材料

对照品芒柄花素（批号：111703-200501，供鉴别用，中国食品药品检定研究院，经HPLC峰面积归一化法检测，质量分数为99.12%）；乙腈、磷酸、甲醇、三氯甲烷均为色谱纯，其他化学试剂为分析纯，水为超纯水；10批广西不同产地网络鸡血藤根药材（见表1），经广西中医药研究院黄云峰副研究员鉴定为豆科植物网络崖豆藤的干燥根。

表1 网络鸡血藤根药材来源信息表Tab 1 Source of Millettia reticulata radix

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Purospher STAR RP-18 endcapped（4.6 mm×250 mm，5 µm），流动相为乙腈（A）和0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表2），流速1.0 mL·min－1，检测波长249 nm，柱温30℃，进样量10 μL。

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 供试品溶液的制备

称取网络鸡血藤根药材粉末（过2号筛）约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液50 mL超声提取（功率：200 W，频率：37 kHz）30 min，过滤，药渣用30 mL三氯甲烷-甲醇（4∶1）混合溶液洗涤3次，每次10 mL，合并滤液蒸干，残渣加甲醇溶解定容到5 mL量瓶中，摇匀，0.45 µm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 对照品溶液制备

精密称取芒柄花素对照品15.74 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解定容作为对照品储备液，精密吸取上述对照品储备液3 mL置20 mL的量瓶中，加甲醇定容，即得质量浓度为23.61 μg·mL－1的对照品溶液。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一批（S1）网络鸡血藤根样品，按“2.2”项下的方法制备，连续进样6次，记录指纹图谱，以4号峰为参照物峰，结果各共有峰相对峰面积的RSD为0.14%～4.9%，相对保留时间的RSD为0.091%～1.8%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批（S1）网络鸡血藤根样品，按照“2.2”项下条件平行制备6份，进样测定，记录指纹图谱，以4号峰为参照物峰，结果各共有峰相对峰面积的RSD为2.2%～4.9%，相对保留时间的RSD为0.10%～0.13%，表明该方法重复性好。

2.4.3 稳定性试验 取同一批（S1）网络鸡血藤根样品，按照“2.2”项下方法进行制备，分别在0、1.5、3、6、12、24 h，进样测定，以4号峰为参照物峰，结果各共有峰相对峰面积的RSD为0.18%～4.3%，相对保留时间的RSD为0.060%～0.24%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5 指纹图谱的建立

分别取10批不同产地网络鸡血藤根药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图，并导入国家药典委员会《中药指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行全谱匹配，以S1号色谱图为参照图谱，采用中位数法生成共有模式R，共确定了17个共有色谱峰（见图1）。经过与对照品图谱对比，指认13号峰为芒柄花素（见图2），4号峰峰面积较大，且分离度符合要求，故设为参照物峰，计算得到10批图谱中各共有峰相对保留时间的RSD值均小于1.1%，表明各共有色谱峰保留时间稳定，但相对峰面积的RSD值为53.9%～146.4%（见表3），差异较大。说明10批网络鸡血藤根药材在化学成分种类上具有一致性，但各批次同一成分的含量差异明显。

图1 10批网络鸡血藤根药材HPLC指纹图谱重叠图Fig 1 Overlapping map of the HPLC fingerprints of 10 batches of Millettia reticulata radix

图2 芒柄花素对照品Fig 2 Formononetin reference substance

3 数据分析

3.1 指纹图谱相似度分析

采用国家药典委员会《中药指纹图谱相似度评价系统》（2012版），计算10批网络鸡血藤根药材的相似度，以S1号色谱图为参照图谱，采用多点校正法进行色谱峰匹配，中位数法生成共有模式（R），结果各批药材的相似度值在0.801～0.951（见表4），说明各产地的药材有较好的一致性，本研究建立的指纹图谱可以用于网络鸡血藤根药材的质量控制。

表4 10批网络鸡血藤根药材相似度分析结果Tab 4 Similarity analysis of 10 batches of Millettia reticulata radix

3.2 聚类分析

以网络鸡血藤根药材HPLC指纹图谱的17个共有峰的峰面积为特征，得到 17×10阶原始数据矩阵，运用 SPSS 23.0 分析软件对其进行聚类分析，采用组间连接法，以欧式平方距离为测度，Z标准化，对样品进行聚类分析，结果如图3。当分类距离为10时，10批网络鸡血藤根药材可以聚为三大类，其中S1、S4、S6、S7、S8、S9、S10 聚为第Ⅰ类；S2、S3聚为第Ⅱ类；S5单独聚为第Ⅲ类。

图3 10批网络鸡血藤根药材聚类分析图Fig 3 Cluster analysis diagram of 10 batches of Millettia reticulata radix

3.3 网络鸡血藤根指纹图谱的主成分分析

主成分分析运用数学中的降维思想，在基本保留原始指标信息的前提下，以互不相关的综合指标来反映原始指标所提供的信息。将10批样品的17个共有峰的峰面积作为变量，通过SPSS 23.0 软件进行数据Z标准化处理，并作为新变量进行主成分分析。计算主成分的特征值及方差贡献率见表5。从表5可以看出，网络鸡血藤根主成分分析中成分1、2、3、4 主成分的特征值均＞1，累积方差贡献率87.219%。进一步分析主成分载荷矩阵，主成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大小和作用方向，载荷的绝对值越大，对主成分的贡献越大，见表6，从表6可以看出，主成分1 的信息来自色谱峰1、3、6、13、16，其中13号峰为芒柄花素，主成分2 的信息来自色谱峰9、12、14，主成分3 的信息来自色谱峰8、10，主成分4 的信息来自色谱峰4、15。

表5 主成分特征值及方差贡献率Tab 5 Principal component eigen values and variance contribution rate

表6 主成分载荷矩阵Tab 6 Principal component loading matrix

4 讨论

本研究对10批不同产地网络鸡血藤根的HPLC指纹图谱进行相似度分析、聚类分析和主成分分析。结果发现10批网络鸡血藤根药材之间相似度均大于0.8，说明药材中化学成分相似度较高，各产地的药材有较好的一致性。但是不同产地药材各共有峰含量差异较大，通过对10批药材指纹图谱以及17个共有峰峰面积的比较，发现相似度低于0.9的4批药材呈现两个极端，S4、S7、S9指纹图谱各峰含量相比其他批次都较小，17个共有峰峰面积总和排名最后三位，S5指纹图谱各峰含量是10批药材中最高的，17个共有峰峰面积总和排名第一，是排名最后的S7总峰面积的5倍多，证明了药材的生长环境对药材有效成分的含量影响非常大，这对我们后期规范种植选址具有重要的参考意义。

采用SPSS 23.0分析软件系统聚类发现，可聚为三大类，其中S1、S4、S6、S7、S8、S9、S10 聚为第Ⅰ类；S2、S3聚为第Ⅱ类；S5单独聚为第Ⅲ类。由图3可以看出S5被单独聚为一类，S4、S7、S9在第Ⅰ类中被单独聚为一小类，与相似度分析的结果基本一致。

采用SPSS 23.0分析软件进行主成分分析，确定 4个主成分，其方差贡献率依次为39.421%、23.888%、15.202%、8.708%，累积方差贡献率为87.219%，代表了网络鸡血藤根药材80%以上的信息。进一步分析主成分载荷矩阵，考察各峰对主成分的贡献大小。结果表明色谱峰1、3、6、13、16，对主成分1的贡献率较大，可作为网络鸡血藤根质量评价指标成分，其中13号峰为芒柄花素，为后期含量测定标准的建立提供依据和参考。

传统瑶药由于成分复杂，需要利用现代色谱技术对尽可能多的化学成分进行表征。本试验建立了不同产地网络鸡血藤根药材 HPLC 指纹图谱，对其中1个共有峰进行了化学成分指认，初步反映了网络鸡血藤根整体化学特征，同时结合聚类分析和主成分分析多方面评价网络鸡血藤根质量，为其整体质量控制提供了依据。