微囊泡在肿瘤中的研究进展

谢舟颖，袁一超，熊友香，孙巧仪，朱新悦，张纪平，朱志红（浙江中医药大学，杭州 311402）

微囊泡是一种膜性胞外细胞器，是由被激活细胞的细胞膜产生的异质囊泡，其直径通常在100～1000 nm[1-3]。微囊泡在人体内分布较广泛，多种细胞都具有分泌微囊泡的生理功能，且在出血、炎症刺激等特定情况下也会形成微囊泡[4]。释放到循环系统中的微囊泡具有调节凝血和血管功能的作用，可以影响细胞凋亡和分化、刺激炎症因子释放[5]。此外，微囊泡可以充当细胞间信使，将不同物质从亲本细胞转移到靶细胞。因此，微囊泡逐渐成为实现体内药物靶向转运的载体。本文通过查阅近年来国内外相关文献，归纳微囊泡分离及纯化的方式和在疾病进程中的阶段性作用，以期为微囊泡的进一步开发利用提供参考。

1 资料来源

1.1 检索方法

检索PubMed、中国期刊全文数据库（CNKI）2006年至2022年3月的相关文献。在PubMed数据库检索中输入“Microvesicle，Cancer，Isolation and Identification”，单词之间以“AND”形式检索，在中文期刊全文数据库中输入主题词“微囊泡、癌症、分离与纯化”以“并且”形式关联选择模糊查询进行检索。主要选择内容与微囊泡治疗癌症有关的文章，同一领域文献则选择近期发表在权威杂志的文章。

1.2 资料筛选

纳入标准：文献所述内容与分离提取微囊泡及微囊泡在癌症等疾病中的应用密切相关。

排除标准：内容较旧或者重复的文献。

1.3 资料的提取与文献质量评价

通过计算机检索，初检得到文献128篇，其中英文104篇，中文24篇。通过阅读摘要进行初筛，共保留68篇文献进一步分析。

2 微囊泡的特点

微囊泡是由两亲性分子形成的多腔室双分子层球形结构[6]，内含蛋白质、脂质、核酸等生物活性物质，其表面含有的特殊蛋白质标志物是其鉴定分离的基础[7]。其次，微囊泡的来源众多，不同来源的微囊泡在不同疾病中发挥的作用亦不同[4]。Diamant等[8]研究表明外周动脉疾病患者体内大量存在的血小板源性的微囊泡能加快疾病进程，因而病理性微囊泡成为动脉血管疾病治疗的新突破口；张戎等[9]发现骨髓间充质干细胞来源的微囊泡可促使干细胞重新恢复成骨分化能力和免疫调节能力，可用于治疗骨质疏松；尚政军[10]研究发现肿瘤细胞来源的微囊泡能加快口腔鳞状细胞癌的病情发展，为此类疾病的治疗提供了新的思路。

微囊泡较好的生物相容性与细胞间信使作用，为药物体内的有效运输提供了新的可能性[3]。此外，微囊泡的成分会在机体发生疾病时产生相应变化，有助于时刻监测疾病进程，实现诊疗一体化[2]。余自力[11]以人体液来源的微囊泡为载体，将具有抗肿瘤作用的siRNA载入其中得到了较好的肿瘤靶向治疗效果。

3 微囊泡的形成和分泌

微囊泡由细胞表面起泡向外出芽和分裂释放而得，质膜的脂质和蛋白质组成以及Ca2＋水平方面的分子重排、核内体分选复合体机制均是参与微囊泡释放过程的重要因素[12]。如细胞内Ca2＋增加引起质膜不对称磷脂分布改变，导致肌动蛋白细胞骨架维持解聚促进微囊泡脱落[13]；小GTPaseADP-核糖基化因子6（ARF6）能通过酶机制引起放线肌球蛋白收缩以释放微囊泡[14]。多数真核细胞在生理和病理状态下都会释放微囊泡，肿瘤细胞的致癌信号和独特的肿瘤微环境（缺氧、酸度）均为微囊泡分泌提供了良好的条件[15]。

4 微囊泡的获取、分离与纯化

4.1 微囊泡的获取

正常情况下，机体细胞单位时间内产生微囊泡较少，当研究需要大量微囊泡时需对细胞进行特殊处理，现阶段的主要处理方式有细胞饥饿法、紫外线照射法或放射法[3]。

4.1.1 细胞饥饿法 细胞饥饿法即在培养细胞时，选用无血清或低血清培养基减少细胞可获取的营养物质迫使细胞处于饥饿状态，从而短时间内分泌大量微囊泡。细胞饥饿法简单易操作，适用于初级实验或者预实验，但因每种细胞对饥饿的耐受力不同，需进行预实验以准确掌握饥饿时间，保证细胞存活的同时获得最多数量的微囊泡。姚嘉等[16]运用细胞饥饿法获得了人脐带间充质干细胞分泌的微囊泡。

4.1.2 紫外线照射法 紫外线照射法是通过适量紫外照射对细胞进行预处理，使其产生大量微囊泡。该法操作简单，紫外线照射剂量是关键，紫外线照射剂量过低则产生微囊泡数量不够，过高则易导致细胞死亡。该法适用于初级实验和需求量、准确度都较高的实验。刘娟等[17]用中长波紫外线辐射诱导皮肤成纤维细胞产生微囊泡，结果表明紫外线辐射后生成的微囊泡可导致人皮肤成纤维细胞形态发生改变，倒置显微镜下出现较多的细胞碎片，细胞体积变大，过度伸展，并使细胞增殖率降低。

4.1.3 放射法 放射法是用射线照射细胞使其大量分泌微囊泡。射线杀伤力较强，极易使细胞死亡，导致实验失败，故多数情况下并不采用放射法。

4.2 微囊泡的分离与纯化

微囊泡大量产生之后，需对其进行分离与纯化。目前可用差速离心法、免疫亲和捕获技术、微流体技术等对微囊泡进行分离[18]。

4.2.1 差速离心法 差速离心法利用离心力将不同直径的微囊泡分开，是最常用的分离提取微囊泡的方法。其优势在于操作简单、成本低廉；缺点在于纯度不够高。Chen等[19]在提取人神经干细胞来源微囊泡时，采用超速离心法多次离心提纯微囊泡，结果表明超速离心法可获得粒径为20～200 nm的微囊泡，且获得的人神经干细胞来源微囊泡可以促进神经细胞的修复和再生。

4.2.2 免疫亲和捕获技术 免疫亲和捕获技术是使用和微囊泡表面特异性标志物相对应抗体的磁珠与微囊泡共同培养，使抗原与抗体结合形成沉淀，从而将微囊泡吸附出来。该法一般应用于复杂生物流体或者小体积液体微囊泡。Zhang等[20]利用此技术成功纯化得到可作为药物载体且被叶酸修饰的微囊泡。

4.2.3 微流体技术 微流体技术是知晓目标粒子直径后，利用仪器控制流体速度、障碍颗粒物尺寸及对流控制粒子，分流出接近、小于或大于阈值直径的三种粒子，使得到的微囊泡纯度更高。Santana等[21]基于微流体技术，利用三种直径不同的微球成功分离出微囊泡。Santana等[21]首先通过细胞饥饿法诱导产生微囊泡，随后将离心分离的微囊泡上清液通过0.22 μm Steriflip过滤器过滤，利用过滤器中荧光聚戊二烯微球的三种直径（51 nm、190 nm和2.01 μm）来分离出不同大小的微囊泡。

截至目前，由于微囊泡体积小、密度低造成其分离难度大，想要得到纯净的微囊泡则必须将其与其余膜结构区分开来，难度更高，为得到较为纯净的微囊泡，一些新技术，例如利用折射不同波长的纳米探针实现对囊泡的特异性生物检测与分离、利用软光刻方法制备微流控芯片并用恒压注射泵制备大小均匀的微囊泡等技术应运而生[22]。

4.3 微囊泡的表征

4.3.1 电子显微镜 扫描电子显微镜和透射电子显微镜是用于微囊泡表征和可视化的常规方法之一，运用电子束穿过微囊泡可得到直观的图像，但一般测量前需对微囊泡进行固定、脱水等处理，这会对微囊泡造成损害，且电镜仅可用于微囊泡形态、直径的测定，不可测定其浓度。冷冻电镜（cryo-EM）能区分微囊泡和非泡状颗粒，获得更详细的微囊结构信息，如Garaeva等[23]运用cryo-EM对天然葡萄柚来源的微囊泡进行表征，获得了粒径、脂质双分子层厚度及形态等信息。并且cryo-EM能减少预处理从而有效避免微囊泡形态变化及损伤。低温电子断层扫描可进一步建立微囊泡三维图像，验证其球形形态[24]。

4.3.2 纳米粒子跟踪分析（NTA）和电阻脉冲传感（RSP） NTA可通过追踪悬浮粒子的布朗运动估计粒子的平均尺寸与浓度，操作简单迅速，检测过程几乎对微囊泡无影响，也可通过荧光检测微囊泡上的抗原组成。Dlugolecka等[25]运用荧光NTA检测非小细胞肺癌患者支气管肺灌洗液来源的微囊泡相关蛋白获得了其浓度、大小、分布及表面表型，但对于如血浆等复杂生物流体，此法检测灵敏度降低。大囊泡可能掩盖小囊泡，荧光强度不够则无法被检测，这些都会降低检测结果的准确性。

RSP是一种基于Coulter原理测定悬浮液中微囊泡大小与浓度的方法，测量前须除去大颗粒和蛋白质防止其堵塞装置孔道，运用广泛，但其检测重现性有待提高。Cimorelli等[26]已证实微流控RSP对65～75 nm生物流体中微囊泡有较好的测量重现性，并以此建立了一个准确且可重复的操作程序以检测微囊泡浓度和粒径分布。

NTA和RSP是最常用于估计粒子大小和浓度的两种方法，但无法区分微囊泡和非微囊泡颗粒。

4.3.3 流式细胞术（FC） FC可用于确定单个微囊泡的细胞来源，对其进行高分辨率和定性分析，提供浓度、表型等相关信息，但微囊泡光散射信号微弱，小微囊泡携抗原少，免疫荧光测量存在一定误差且重现性差，大多传统流式细胞仪对直径＜500 nm的微囊泡灵敏度不够[27]。Pospichalova等[28]研究表明，通过蛋白质和脂质特异性染料或第一抗体标记微囊泡能提高FC检测灵敏度，实现对微囊泡进行常规定量分析和表征。成像流式细胞术（IFC）结合了传统流式细胞仪和显微镜的优点，能获取高质量的多光谱图像，对单个微囊泡的检测准确度更高，Ofir-Birin等[29]通过对疟原虫来源微囊泡内蛋白质、RNA和脂质进行荧光标记，加以IFC实时追踪，能直观地监测疟疾患者免疫细胞对微囊泡的摄取及摄取后微囊泡运载物质的分布，为探究微囊泡内化过程提供了又一强有力的方法。

4.3.4 抗体特异性酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白免疫印记分析 纳米到微米级微囊泡表达特异性抗体，ELISA通过与抗体相连的酶产生的检测信号，检测和定量测定特定细胞来源的微囊泡，但微囊的异质性和亚型限制了此法对微囊泡总浓度的测定[30]。Ma等[31]建立高亲和力磷脂酰丝氨酸结合剂TIM4-ELISA系统，运用多种抗体提高检测微囊泡的灵敏度成功鉴定出一种微囊泡分泌抑制剂和三种微囊泡分泌激活剂。

蛋白免疫印记分析用于确认微囊泡主要标记物（Alix或CD63）和微囊泡的蛋白质的存在。Sung等[32]运用蛋白质印迹法对脊柱硬膜外脂肪间充质干细胞细胞外囊泡进行表征，以外体融合蛋白flotillin 2、CD81等微囊泡标志物作为分析指标。

Dong等[33]利用尺寸排阻分离和光子晶体纳米结构结合CD63配体研制了一种集成芯片，可灵敏定量测定微囊泡。

4.3.5 其他 其他方法还有动态光散射、原子力显微镜、荧光激活细胞分选等，以上方法各有利弊，故微囊泡的表征常采用多种方法，从而实现对微囊泡进行精确全面的分析识别、对微囊泡亚群进行分类以及对具有功能效应的特征进行深入研究。

5 微囊泡在肿瘤疾病中的作用

微囊泡具有较好的生物相容性且表面易修饰，可将靶向基团通过 “自然嵌合”等方式与之结合，使其具有靶向性[34-35]。此外，微囊泡可通过调节分子和信号通路，参与肿瘤发展，可用于各类癌症早期的诊断、监测及预后[36]。微囊泡作为细胞间信号传导的通路，其数量的变化与疾病的产生密切相关[37-38]。

5.1 肝癌

肝癌细胞通常表现为耐药性强、易复发，且多数患者确诊即为晚期，因此确定一个合适的肝癌早期诊断指标显得尤为重要。考虑到无论是正常细胞还是病变细胞，都通过释放微囊泡与其他细胞产生联系。Hsu等[39]对肝癌细胞分泌的微囊泡中的M2型丙酮酸激酶（PKM2）进行检测，发现肝癌患者血浆微囊泡中PKM2明显升高，可作为肝癌早期诊断标志。而吴丁[40]提出的石墨烯场效应晶体管生物传感器大幅提高了微囊泡的检测灵敏度，提高了其在临床应用的可能性。

肝癌的转移扩散是导致患者病情恶化的重要原因，肝癌分泌的微囊泡与其癌症的发展密切相关，可将其作为潜在的治疗靶点。He等[41]研究表明上皮细胞来源的微囊泡作为CRISPR/Cas9的载体可治疗肝癌，且进一步研究表明肝癌细胞来源的微囊泡可以介导肝癌细胞对索拉非尼的耐药[42]，提示这类微囊泡可能不能作为肝癌治疗中抗肿瘤药物传递的载体。Kogure等[43]提出肝癌细胞来源的微囊泡与肝癌细胞增殖有所关联，肝癌细胞分泌的微囊泡通过介导 miRNA 的转移来激活相关信号通路并调节TAK1 的表达，从而增强肝癌细胞增殖能力。Fang等[44]发现肝癌细胞分泌的微囊泡含有miR-103可在破坏内皮细胞的同时加剧肝癌细胞扩散，因此，若能抑制肝癌细胞分泌微囊泡可对肝癌病情产生极大缓解。

5.2 肺癌

肺癌是全球病死率最高的癌症，肺癌死亡的人数占所有癌症死亡人数的18.4%[45]。Kanazawa等[46]经研究发现肺癌患者中血小板微囊泡及单核细胞微囊泡数量高于健康人，故认为血小板微囊泡浓度可作为非小细胞肺癌的进展指标。Tseng等[47]发现贫血小板血浆中的组织因子阳性微囊泡可预示肺癌向远处转移，可作为检测肺癌扩散的指标。

肺癌患者血小板来源的微囊泡在促进A549细胞增殖的同时可加强促血管生成基因的表达，加快肺癌的发展。Janowska-Wieczorek等[48]给小鼠静脉注射其血小板来源的微囊泡后发现人肺癌细胞系A549迁移性明显增强，进一步证明微囊泡在肿瘤迁移和血管生成中发挥重要作用。在肺癌预后研究中，通过测定107例非小细胞肺癌患者血小板微囊泡和内皮细胞微囊泡的数量及循环总微囊泡数量，表明微囊泡基线水平与肺癌预后息息相关，基线水平高则表示预后良好[49-50]。

5.3 卵巢癌

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，是妇科恶性肿瘤病死率最高的疾病[51]。研究表明在卵巢癌患者血液中微囊泡数量明显上升，可成为临床“体液检查”的理想选择[52]。Cicek等[53]发现卵巢癌患者血清中分离出来的微囊泡包含特定的miRNA，可以用于恶性肿瘤的早期检测的标志。Barnabas等[54]在Q-Exactive质谱仪上对微囊泡样品进行数据分析，并成功构建一个9个蛋白质的分类器，经验证能正确识别所有卵巢癌患者Ⅰ期病变，其实验结果为微囊泡能成为早期癌症诊断依据提供有力证据。

Mancilla等[55]通过研究浆液性卵巢癌小鼠模型，发现辛伐他汀可影响肿瘤细胞释放微囊泡数量及微囊泡的组成，导致微囊泡诱导的肿瘤细胞侵袭和迁移明显减少，有望成为新的治疗卵巢癌的途径。在治疗过程中耐药性是卵巢癌治疗失败的主要原因之一。多个实验结果表明，肿瘤细胞能释放大量含各种蛋白酶、mRNA和信号分子的微囊泡，在肿瘤发展过程中起到重大作用，最终可导致细胞耐药[56-57]。同时Jorfi等[58]研究表明，肿瘤细胞利用微囊泡排出抗肿瘤药物，产生耐药性。

5.4 乳腺癌

乳腺癌在全球女性癌症中的发病率为24.2%，位居女性癌症的首位，其中52.9%患者来自发展中国家。秉持着早发现早治疗的原则，Kosaka等[59]通过研究发现乳腺癌患者血清中微囊泡数量明显高于常人，有望作为临床诊断的标志。

在治疗过程中，朱链[34]利用叶酸与生物素双修饰的微囊泡，负载紫杉醇和Bcl-2siRNA，实验结果表明对乳腺癌细胞有较强杀伤效果。Risha等[60]研究发现乳腺癌细胞分泌微囊泡中的癌症治疗靶点活性高于非癌性细胞微囊泡。Chulpanova等[61]从IL2过表达间充质干细胞中分离的微囊泡可激活Cd8T用于杀死三阴性乳腺癌细胞。在化疗过程中，汪林军等[62]研究发现血浆微泡中的mRNA可能是预测乳腺癌患者化疗疗效的潜在标志物，有望通过检测血浆微泡中的mRNA及时调整化疗方案。Park等[63]发现载有CXCL12 特异性 miRNA的微囊泡，可减少乳腺癌细胞增殖，抑制乳腺癌的进一步发展。Menck等[57]通过研究表明乳腺癌细胞分泌的微囊泡含有大量细胞外基质金属蛋白酶诱导剂，可加剧肿瘤细胞发展。Menck等[14]在随后研究中发现在转移性乳腺癌患者血液中的微囊泡也存在类似现象，这说明乳腺癌细胞能通过分泌微囊泡扩散，为临床抑制乳腺癌提供了潜在途径。

6 其他

6.1 微囊泡在肺部疾病中的运用

通过检测不同来源微囊泡的数量及其携带的标志物可诊断肺纤维化的发生及判断肺栓塞的程度[64-65]。研究发现，微囊泡对哮喘、肺动脉高压、肺癌等疾病也起到一定的治疗作用[66-68]。肺部疾病的预后检查中常以不同来源微囊泡及其携带的生物标志物变化情况为依据判断慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫综合征康复患者的康复情况[69]。

6.2 微囊泡在心血管疾病中的运用

微囊泡随着血液循环与众多细胞接触且影响受体细胞的表型，所以细胞源性微囊泡在心血管疾病的预测、发生和进展中是一个重要标志物[70]。微循环系统内的微囊泡与内皮细胞的比值可作为心血管功能障碍的生物标志物和动脉粥样硬化的提示，并且利用微囊泡特异性可区分不同阶段和不同发展程度的心血管疾病[71]。在治疗中，微囊泡可改善血脂异常、高血压，抑制心肌细胞的凋亡[72]。与此同时微囊泡可作为高胆固醇血症患者动脉粥样硬化加速和预后检测的标准[73]。

6.3 微囊泡在组织修复及再生中的运用

不同类型细胞分泌的微囊泡，通过介导不同因子在组织修复中发挥不同作用。

由滑膜或脂肪来源的间充质干细胞分泌的微囊泡，通过介导不同因子实现患骨关节炎后软骨的再生，有望改善类风湿关节炎等[74-75]。自然杀伤细胞、血小板分泌的微囊泡则会抑制内皮细胞的生长及迁移，成为组织修复类疾病康复的阻碍[76-77]。T细胞来源微囊泡，可改变血管内皮功能和屏障通透性，加剧组织炎症，同时也为治疗提供了新的思路[78]。通过检测已完成异基因造血细胞患者循环微囊泡的数量，及时发现患者是否存在明显血管损伤或凝血现象，以便及早治疗[79]。

6.4 神经细胞及神经系统

神经细胞分泌的微囊泡在神经系统疾病的修复与治疗中发挥重要作用。研究表明胚胎干细胞衍生的神经干细胞分泌的微囊泡，可使受损坐骨神经再生[19]。实验证明，人神经干细胞分泌的微囊泡对经谷氨酸诱导受损的大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞有修复作用[80]。临床上成人神经系统难以再生，但有实验表明人神经干细胞可促进大鼠神经元轴突的增长，进一步研究可以分析神经干细胞分泌的微囊泡能否促进神经元轴突的增长，可为微囊泡临床应用打下了基础[81]。

7 总结与展望

微囊泡作为新型天然药物传递载体，具有较高的生物相容性、较强的稳定性和有限的免疫原性[82]及细胞毒性，与传统的合成给药载体相比能更安全有效地应用在临床。微囊泡渗透到组织中时，可提高药物的靶向性；作为生物标志物，通过检测血液中不同来源的微囊泡能对癌症等疾病的诊断、治疗以及疾病进程的判断起到良好的辅助作用[83-84]。目前将微囊泡广泛运用在临床上的限制在于难以实现大规模生产和标准化鉴定、表征和定量，效能低而成本高[85-86]；无修饰的微囊泡药物装载效率低，现有的装载方法[82]有待优化创新，建立标准化的微囊泡分离纯化方法及开发临床级微囊泡制备方法也是未来微囊泡研究的重难点；微囊泡在外周血中清除速率较快也是限制其应用的一大因素[87]，且微囊泡在部分疾病的作用研究依旧停留在动物实验阶段[88]。未来攻克的关键就在于如何提高性质稳定的微囊泡的提取效率、拓宽微囊泡的来源并加快微囊泡应用于临床的脚步，从而为患者提供更加精准安全的治疗方案，使微囊泡成为疗效更好、治疗范围更广的药物载体。

总之，真正将微囊泡应用于临床还面临着诸多挑战和困难，但其本身具有合成类药物载体无可比拟的优势，这决定了只要攻克其应用的限制因素，微囊泡必然会在生物医药学领域大放光彩，成为一项全新、先进、高效的递药和治疗手段。