七氟烷对大鼠脊髓缺血再灌注损伤及Wnt/βcatenin信号通路的影响*

张 敏，康文越，邢丹丹，吴多志，林 慧

（海南省人民医院，海南海口 570311）

脊髓缺血再灌注（spinal cord ischemia-reperfusion，SCIR）是胸腹主动脉和脊柱手术的严重并发症，可能导致瘫痪和截瘫［1］。因此，寻找减少SCIR 损伤的策略很有必要。首先脊髓缺血造成其中的细胞缺血缺氧，随后的再灌注导致细胞内钙超载、炎症反应及氧自由基爆发，最终引起神经细胞凋亡、脊髓组织损伤及功能障碍［2］。七氟烷（sevoflurane，SEVO）为常用的麻醉诱导和维持药剂［3］。近年研究显示，SEVO 可通过抗凋亡、抑制自噬、抑制氧化应激和抗炎等对肝［4］、大脑［5］、肺［6］及脊髓［7］等产生保护作用。目前，SEVO 对脊髓等中枢组织缺血性损伤的改善效果已被多项研究证实［5，8-9］，然而其机制主要集中于对凋亡、炎症和氧化应激等抑制的的探讨，对脊髓中受损轴突的自我修复和再生的探讨较少，而后者是神经损伤后功能恢复的生理基础［10］。Wnt/β-catenin 通路是进化保守的经典信号通路，负责调节细胞存活、生长、分化等过程，其活化可促进视神经［11］及脊髓［10］损伤后的轴突再生，实现对神经损伤的缓解。然而SEVO 对SCIR 损伤后轴突再生的作用并不清楚，本研究拟采用胸主动脉阻断法建立SCIR 大鼠模型，观察吸入SEVO 对SCIR 大鼠轴突再生和Wnt/β-catenin通路的影响，以探讨其机制。

材料和方法

1 动物

40 只雄性SPF 级SD 大鼠，6 周龄，体重180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（京）-2016-0011］。在湿度为（40±5）%、温度为（23.0±0.5）℃、光/暗循环为12 h/12 h 动物房中饲养1周以适应环境。

2 主要试剂

SEVO（吸入用）购自上海恒瑞医药有限公司；βcatenin 抑制剂XAV939（XAV）购自MCE；β-catenin、生长相关蛋白43（growth-associated protein 43，GAP43）和硫酸软骨素蛋白聚糖NG2（chondroitin sulfate proteoglycan NG2，NG2）抗体购自Abcam；微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）抗体购自Invitrogen；神经丝H（neurofilament-H，NFH）、髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）、GAPDH 和lamin B 抗体，以及羊抗兔（Alexa Fluor®488、HRP）或小鼠（Alexa Fluor®594）IgG 购自Cell Signaling Technology；PVDF 膜和ECL 试剂购自Millipore；HE 试剂、TUNEL 凋亡试剂盒、Nissl 染色液、总及核蛋白提取试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。小动物生理记录仪为iWorx产品。

3 主要方法

3.1 SCIR 模型建立［12］术前大鼠均禁食12 h，经腹腔注射2%戊巴比妥钠（2 mL/kg），麻醉后仰卧固定，切开左颈肌肉暴露总动脉，置入24G 套管针并连接肝素处理的小动物生理记录仪和储血装置，将24 G套管针刺入尾动脉并连接小动物生理记录仪，检测远端动脉压。全身肝素化后，切开腹部肌肉暴露左髂总动脉，置入球囊套管推至胸主动脉开口，往套管中注入0.05 mL 生理盐水，使球囊鼓起以阻断主动脉。远端动脉压＜10 mmHg 则表明阻断成功。随后立即拨动三通阀，将约6 mL 血液流入储血装置，控制体循环平均动脉压为40 mmHg，实现脊髓缺血并维持9 min后，恢复主动脉血流，实现脊髓再灌注。

3.2 动物分组及给药 随机数字法将SCIR 大鼠分为SCIR 组、SEVO 组、SEVO+XAV 组，每组10 只，另外选取假手术（sham）组10 只。SEVO 组造模前吸入3 h 2.4% SEVO［8］；SEVO+XAV 组在吸入SEVO 前先鞘内注射10µL 0.5 mmol XAV［13］；sham 组和SCIR 组同步吸入空气并鞘内注射生理盐水。再灌注96 h后对所有大鼠进行BBB评分［14］。

3.3 样本采集 评分后，各组大鼠随机取5 只，麻醉后断头取L4～L6 段脊髓，-80 ℃保存；余下5 只收集L4～L6 段脊髓，浸没在包埋剂OCT 中速冻后，用恒温冰冻切片机制备脊髓冰冻切片（每片10 µm），加入丙酮固定10 min。

3.4 HE、Nissl 和TUNEL 染色 取3.3 的脊髓冰冻切片，经PBS冲洗后，分别加入HE染色试剂、Nissl染色试剂和TUNEL 试剂孵育，之后洗片、封片，光镜下观察脊髓组织形态及细胞凋亡、坏死情况。

3.5 免疫组化染色 取3.3 的脊髓冰冻切片，经PBS 冲洗、羊血清封闭后，滴加Ⅰ抗（兔抗大鼠NF-H或MBP，稀释比1∶500）4 ℃孵育过夜，滴加Ⅱ抗（稀释比1∶2 000）孵育1 h，滴加二氨基联苯胺（DAB）显色、苏木素复染后封片，光镜下拍照并计数。

3.6 免疫荧光染色 取3.3 的脊髓冰冻切片，经PBS 冲洗、羊血清封闭后，滴加Ⅰ抗（兔抗大鼠GAP43 或MBP 和小鼠抗大鼠β-catenin，稀释比1∶50）孵育3 h，滴加Ⅱ抗（羊抗兔Alexa Fluor®488 或羊抗小鼠Alexa Fluor®594 IgG，稀释比1∶1 000）避光孵育1 h，回收Ⅱ抗，滴加抗荧光淬灭封闭液封片，荧光显微镜下拍照并计数。

3.7 Western blot 检测 采用试剂盒提取脊髓组织（-80 ℃）中总蛋白和细胞质、核蛋白。定量后，各组取20µg蛋白沸水浴变性，加样，电泳完成后，将胶中蛋白电转印到聚偏二氟乙烯膜上，将膜依次与封闭液（5%脱脂奶粉溶液）孵育1 h、Ⅰ抗（GAPDH、lamin B、GAP43、NF-H、MAP2、NG2、MBP 和β-catenin，稀释比1∶1 000）4 ℃孵育过夜、Ⅱ抗（稀释比1∶3 000）孵育1 h、化学发光液作用5 min 后，放在蛋白凝胶成像仪中拍照，分析各条带灰度值。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0 进行数据分析。用均数±标准差（mean±SD）描述各项数据。单因素方差分析行多组间比较，SNK-q检验行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 SEVO对后肢功能评分的影响

sham 组各大 鼠BBB 评分均 为21.00；SCIR 组BBB 评分较sham 组显著降低（P＜0.01）；SEVO 组BBB 评分较SCIR 组显著升高（P＜0.01）；SEVO+XAV组BBB评分较SEVO组显著降低（P＜0.01），见图1。

Figure 1.The BBB score of the rats in each group.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs SCIR group；##P＜0.01 vs SEVO group.图1 各组大鼠的BBB评分

2 SEVO对脊髓组织损伤的影响

sham 组脊髓组织中神经纤维排列规则，未见肿胀或核固缩神经细胞，凋亡细胞较少，尼氏小体较多；SCIR组脊髓组织有空洞，可见较多肿胀或核固缩的坏死或凋亡细胞，尼氏小体较少；SEVO 组脊髓组织损伤有所减轻，凋亡细胞减少，尼氏小体增多；SEVO+XAV 组脊髓组织损伤相比于SEVO 组加重，可见较多肿胀或核固缩的坏死或凋亡细胞，尼氏小体较少，见图2。

Figure 2.HE staining，Nissl staining and TUNEL staining to observe the morphological changes of the spinal cord.The scale bar=100µm.图2 HE染色、Nissl染色和TUNEL染色观察脊髓组织形态

3 SEVO对脊髓轴突再生及髓鞘形成的影响

SCIR 组NF-H+和MBP+细胞数量显著低于sham组（P＜0.01）；SEVO 组NF-H+和MBP+细胞数量显著高于SCIR 组（P＜0.01）；SEVO+XAV 组NF-H+和MBP+细胞数量显著低于SEVO组（P＜0.01），见图3。

Figure 3.Immunohistochemical staining of spinal cord tissues.The scale bar=100 µm.A：NF-H staining（brown represents NF-H+cells）；B：MBP staining（brown represents MBP+ cells）.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs SCIR group；##P＜0.01 vs SEVO group.图3 免疫组化法观察脊髓组织再生情况

4 SEVO对轴突再生及髓鞘形成相关蛋白的影响

SCIR 组NF-H、MAP2 及MBP 蛋白水平显著低于sham 组（P＜0.01），GAP43 和NG2 蛋白水平显著高于sham 组（P＜0.01）；SEVO 组NF-H、MAP2、GAP43、NG2 及MBP 蛋白水平显著高于SCIR 组（P＜0.01）；SEVO+XAV 组NF-H、MAP2、GAP43、NG2 及MBP 蛋白水平显著低于SEVO组（P＜0.01），见图4。

5 SEVO 调节Wnt/β-catenin 信号通路促进SCIR大鼠轴突再生

免疫荧光结果显示，β-catenin 和GAP43 基本共表达在同一细胞中，β-catenin 和MBP 也基本共表达于同一细胞。与sham 组相比，SCIR 组β-catenin+GAP43+细胞和β-catenin+MBP+细胞数量显著减少，胞质、胞核和总β-catenin 水平及胞核/胞质β-catenin比例显著降低（P＜0.01）；与SCIR组相比，SEVO组βcatenin+GAP43+细胞和β-catenin+MBP+细胞数量显著增多，胞核和总β-catenin 水平及胞核/胞质βcatenin 比例显著升高（P＜0.01）；与SEVO 组相比，SEVO+XAV 组β-catenin+GAP43+细胞和β-catenin+MBP+细胞数量显著减少，胞核和总β-catenin 水平及胞核/胞质β-catenin 比例显著降低（P＜0.01），见图5、6。

讨 论

Figure 4.Detection of protein levels of NF-H，MAP2，GAP43，NG2 and MBP by Western blot.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs SCIR group；##P＜0.01 vs SEVO group.图4 Western blot检测NF-H、MAP2、GAP43、NG2和MBP蛋白水平

Figure 5.Immunofluorescence staining of GAP43/MBP and β-catenin.A：immunofluorescence staining to observe the co-localization of GAP43 and β-catenin（green represents GAP43+ cells，while red represents β-catenin+ cells）；B：immunofluorescence staining to observe the co-localization of MBP and β-catenin（green represents MBP+ cells，while red represents β-catenin+cells）.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△△P＜0.01 vs SCIR group；##P＜0.01 vs SEVO group.图5 GAP43、MBP及β-catenin免疫荧光染色

尽管SCIR 损伤的发生频率较低，但会导致较高死亡率和致残率，并降低生活质量，因此也应重视其防治。SCIR 时神经元受到冲击出现变性或坏死，伴随组织损伤，表现为细胞肿胀或核固缩变性坏死、尼氏体减少等［12］。尼氏体具有较强代谢功能，为神经元功能的标志物，当神经元受损时，尼氏体会减少或消失［15］。动物实验显示，SCIR 造成的神经损伤还可引起后肢行为障碍［8］。本研究中，SCIR 大鼠脊髓神经细胞出现肿胀、核固缩变性坏死或凋亡，尼氏体减少等情况，且BBB 评分降低，表明成功构建SCIR 模型。研究显示，2.4%SEVO 预处理能有效改善SCIR大鼠神经损伤［8］。本研究亦证实，2.4% SEVO 可显著减轻SCIR 大鼠脊髓组织病变，提高BBB 评分，表明SEVO对SCIR神经损伤有缓解作用。

Figure 6.Detection of protein levels of β-catenin by Western blot.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs SCIR group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs SEVO group.图6 Western blot检测β-catenin蛋白水平

SCIR可破坏脊髓神经元轴突，影响神经传导，且可对邻近组织造成级联的继发性伤害，进一步导致伤害加重［15］。而促进轴突生长、伸长和髓鞘再生，不仅有利于神经元轴突的自我修复与再生，而且可重构神经传导，恢复神经功能［16］。Sachdeva 等［17］研究表明，增加生长相关蛋白GAP43的表达，可诱导轴突出芽、伸长，促进轴突分支的生长，并引导新生轴突向损伤区域生长，重建损伤区轴突结构和功能。在急性脊髓损伤中的研究显示，NF-H 表达与髓轴突计数同步降低［18］，推测NF-H 可作为中枢神经系统神经元轴突的标志物，在轴突径向生长中发挥作用。MAP2则特异性表达在轴突微管中，参与轴突伸长与分支［19］。另外，缺血等损伤后，少突胶质祖细胞迅速增殖、分化为少突胶质细胞，向缺血损伤处迁移，包绕在新生轴突外缘形成髓鞘，对轴突具有支持和绝缘作用，有利于轴突连接的重建［20］。NG2 为少突胶质祖细胞的标志物，可反映髓鞘的再生程度，MBP为髓鞘的重要结构蛋白，可反映髓鞘厚度。本研究中，SCIR 大鼠脊髓NF-H、MAP2 及MBP 蛋白水平降低，GAP43 和NG2 蛋白水平增高，提示SCIR 可造成大鼠脊髓神经元轴突减少和髓鞘损伤，进而减弱或消除神经元之间的信号传递，导致后肢运动障碍，且轴突具有一定自我修复能力，但作用有限，不足以抵抗SCIR 损伤。而SEVO 干预可进一步提高脊髓GAP43和NG2 蛋白水平，同时提高NF-H、MAP2、及MBP 蛋白水平，提示SEVO还可能通过促进轴突和髓鞘的再生，实现对SCIR大鼠神经功能的保护。

经典Wnt/β-catenin 通路的活化通过β-catenin 核易位介导，β-catenin 在细胞中积累并转移入核，可活化启动靶基因表达，提高神经系统轴突分支、生长和重塑能力，是中枢神经损伤后的自我修复机制［21］。研究［11］显示，激活Wnt/β-catenin 通路可促进小鼠视神经的轴突再生和神经节细胞存活，促进神经恢复。Seo 等［22］在脊髓损伤中也观察到Wnt/β-catenin 通路的这种神经保护作用［22］。本研究中，SCIR 组βcatenin 和GAP43 基本共表达在同一细胞，β-catenin和MBP 也基本共表达于同一细胞，部分β-catenin+细胞未见GAP43或MBP表达，可能与SCIR造成神经细胞轴突损伤，轴突标记蛋白GAP43 或MBP 无法成功染色有关。且与sham 组相比，SCIR 组β-catenin+GAP43+细胞和β-catenin+MBP+细胞数量减少，胞质、胞核及总β-catenin 水平降低，胞核/胞质β-catenin 比例也降低，表明Wnt/β-catenin 通路活化程度较低，不能抵抗SCIR 造成的神经细胞轴突损伤。药物干预可激活Wnt/β-catenin 信号通路，促进轴突再生，保护SCIR 损伤后的神经传导［23-24］。本研究观察到SEVO具有类似作用，表现为增加β-catenin+GAP43+细胞和β-catenin+MBP+细胞数量，升高胞质、胞核及总βcatenin 水平，胞核/胞质β-catenin 比例也增高，且βcatenin 抑制剂XAV 可减弱SEVO 促轴突和髓鞘再生的作用及其对SCIR 后受损神经的保护作用，提示激活Wnt/β-catenin 通路可能是SEVO 减轻SCIR 损伤的作用机制，有待更严谨的证明。

综上所述，SEVO 可促进轴突和髓鞘再生，缓解大鼠SCIR 神经损伤，其机制可能与激活Wnt/βcatenin通路有关。