SENP3对ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化的影响*

邵路瑶，刘 媛，殷妮娜

（湖北中医药大学基础医学院，湖北武汉 430065）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心血管系统常见疾病，是冠心病、脑梗死和外周血管病的主要原因［1］。近年来有学者开始认可斑块本质上是泡沫细胞、免疫细胞、胆固醇晶体和平滑肌细胞在炎症因子影响下的增殖和积累［2］。而其中内膜巨噬细胞聚集和泡沫细胞形成是AS 最主要的病变特征［3］，因此如何抑制泡沫细胞的形成或成为治疗AS的关键。

小泛素样修饰物（small ubiquitin-like modifier，SUMO）/sentrin 特异性蛋白酶3（SUMO/sentrin-specific protease 3，SENP3）是SENPs 家族的一员，介导去除底物的SUMO 修饰，主要偏向于去除SUMO2/3 蛋白修饰［4］。SUMO 修饰是一个动态可逆的过程，SENPs去除底物的SUMO 修饰可以影响底物的结构、定位和活性，从而影响其生物学效应。SENP3 是SUMO蛋白酶家族中对氧化应激最敏感的一种，在细胞氧化刺激（如H2O2处理）后，细胞内SENP3 蛋白水平和分布迅速发生变化［5］，帮助调控氧化应激后细胞内蛋白SUMO 修饰情况。而氧化应激也被认为是造成细胞泡沫化的一个重要因素，大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）使低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）发生氧化形成氧化型LDL（oxidized LDL，ox-LDL），被巨噬细胞摄取后使其成为泡沫细胞［6］。

炎症小体是天然免疫中胞浆内模式识别受体参与组装的多蛋白复合物，包括核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1［nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor（NLR）protein 1，NLRP1］、NLRP3、NLRC4（NLR family caspase recruitment domain containing 4）和AIM2（absent in melanoma 2）等可在ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain）的协调下招募pro-caspase-1激活剪切为成熟的caspase-1，进而切割白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 的前体，分泌相应的成熟炎症因子而发挥作用［7］。细胞泡沫化过程中，炎症小体激活和分泌产生的炎症因子IL-1β发挥重要的促进作用，而SENP3也被发现可以调控炎症信号的激活，使促炎因子产生［8-9］。SENP3 与细胞泡沫化的关系尚未有报道，考虑到SENP3与氧化应激、炎症之间的联系，那么SENP3可否影响泡沫细胞的形成？是否可能成为治疗AS 的潜在研究方向？鉴于此，本研究采用ox-LDL 诱导小鼠RAW264.7 和人源THP-1 巨噬细胞形成泡沫细胞，观察过表达和敲减SENP3对泡沫细胞形成的影响，同时探索可能的分子机制，试图为AS 的治疗提供参考资料。

材料和方法

1 实验材料和试剂

人源THP-1单核-巨噬细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞（中国典型培养物保藏中心）；HEK293T 细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）。RPMI-1640 培养液和胎牛血清（Gibco）；DMEM 培养液（HyClone）；人源ox-LDL（广州奕源生物科技有限公司）；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）和嘌呤霉素（北京索莱宝科技有限公司）；质粒小提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；脂肪酸和脂质代谢试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；油红O 染料（上海生工生物工程技术服务有限公司）；人IL-1β ELISA试剂盒（BD）；RIPA 裂解液（弱）和BCA 蛋白含量测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗SENP3 单克隆抗体（Cell Signaling Technology）；兔抗caspase-1 单克隆抗体（Abcam）；辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗（武汉三鹰生物技术有限公司）。

2 主要方法

2.1 细胞培养 选取被国内外学者广泛应用于研究巨噬细胞相关功能的人单核细胞株THP-1 和小鼠巨噬细胞株RAW264.7。将THP-1 细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液中，于37 ℃、5% CO2培养箱静置培养。取对数生长期的THP-1 细胞，用含100 µg/L PMA 的培养液重新铺板于6 孔板，在37 ℃、5% CO2培养箱中分化24 h，之后更换含10%胎牛血清的新鲜培养液即得人源巨噬细胞。小鼠RAW264.7 巨噬细胞则在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、5%CO2条件下恒温培养。

2.2 巨噬细胞泡沫化模型的构建 将获得的巨噬细胞更换新鲜的DMEM 培养液，参考文献报道［10］对诱导THP-1 细胞泡沫化的ox-LDL 浓度实验结果，加入终浓度为100 mg/L 的ox-LDL，共同孵育24 h，油红O 染色后，镜下观察细胞内充满橘红色脂滴，成功得到泡沫细胞模型。

2.3 慢病毒载体的构建和稳定细胞系筛选 按照课题组前期研究中的方法构建慢病毒载体并筛选稳转细胞系［8］。其中干扰小鼠SENP3基因表达的sh-SENP3 序列为5'-GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA-3'，将sh-SENP3 和无意义对照序列sh-NC 构建到pLKO.1 慢病毒载体上，将人源SENP3基因构建到pLenti 慢病毒载体上，两者分别感染RAW264.7 和THP-1 细胞，嘌呤霉素筛选后获得稳定敲减及过表达的细胞系。扩增慢病毒：待HEK293T 细胞在10 cm 板生长密度至70%左右，用Lipofectamine 2000转染试剂转染质粒（pMD2.G 2.5 µg，pSPAX2 7.5µg，构建好的慢病毒目标质粒10 µg）；48 和72 h 后收集病毒上清液，离心去除细胞碎片。慢病毒感染细胞：细胞培养到密度为80%左右，将慢病毒上清液加入Polybrene 至终浓度为6 mg/L，感染细胞。筛选：感染后24 h 细胞换液，48 h 加入1.5 mg/L 嘌呤霉素进行筛选；筛选的过程每隔2～3 d 换液一次，去除死细胞，维持抗生素浓度直到细胞不再死亡。筛选得到的稳定细胞系使用含0.5 mg/L 嘌呤霉素的完全培养液培养、传代。

细胞分为4组：pLenti-SENP3组（SENP3过表达的THP-1 细胞）、pLenti-CT 组（对照THP-1 细胞）、sh-SENP3 组（SENP3敲减的RAW264.7 细胞）和sh-NC对照组（对照RAW264.7 细胞）。在细胞泡沫化模型中，ox-LDL刺激为建立泡沫化模型，mock为未刺激。

2.4 油红O 染色检测脂滴 泡沫细胞建模结束后，吸去上清液，用PBS 洗2 次。预冷的4%多聚甲醛固定15 min，PBS 洗2 次。加入新鲜配制的油红O 染液染色15 min，再用PBS 洗2次，观察染色情况，不佳可复染。60%异丙醇漂洗数秒，分化30 s。苏木素复染2 min，加PBS漂洗并观察染色结果。0.5%盐酸乙醇分色数秒，适量PBS覆盖底板。置显微镜下观察并拍摄油红O染色结果，细胞内脂质为红色，胞核为蓝色。

2.5 酶法测定细胞内胆固醇含量［11］取对数生长期、生长状态良好的SENP3过表达和对照组细胞，以每孔2×106个接种于6孔板，设置复孔；按照胆固醇酶法检测试剂盒说明书操作，并取适量细胞上清液用于BCA 蛋白浓度测定；使用酶标仪测量各孔于550 nm 处的吸光度（A550）；将各标准品和待测样品的A550值减去空白标准品的A550值即为校正后的A550值；以校正后的标准品A550值与其对应的浓度绘制标准曲线，并计算各待测样品的胆固醇浓度；用蛋白浓度校正胆固醇含量。胆固醇酯（cholesterol ester，CE）含量=总胆固醇（total cholesterol，TC）含量-游离胆固醇（free cholesterol，FC）含量；胆固醇酯化率（cholesterol esterification rate，CER；%）=CE/TC×100%。

2.6 Western blot 检测细胞pro-caspase-1、caspase-1和SENP3 蛋白量 收集细胞样品后，加入适量RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂混合物，4 ℃旋转混合仪上旋转裂解30 min 后，10 000×g离心10 min 吸取上清为细胞裂解液样品。配制SDS-PAGE 胶，上样，电泳。转膜：将电泳后的胶取出，用1×转膜液浸泡，置摇床摇30 min。在转膜仪的底板上依次铺好厚滤纸、胶、PVDF 膜和厚滤纸，95 V 转膜75 min。封闭：取出PVDF膜，做标记后，蛋白面朝上用1×TBST漂洗30 s，5%脱脂牛奶封闭液封闭30 min；孵育Ⅰ抗：倒掉封闭液，加入用1×TBST 稀释的Ⅰ抗，摇床上4 ℃过夜；孵育Ⅱ抗：用1×TBST 洗膜液洗3 次，每次10 min，加入1×TBST 稀释的Ⅱ抗室温孵育1 h，1×TBST洗3 次×10 min；ECL 化学发光试剂显影，凝胶成像仪系统呈像；以GAPDH 为内参照，使用Image Lab 软件进行蛋白条带灰度分析。

2.7 ELISA 检测分泌IL-1β 含量 收集细胞上清，按照ELISA 试剂盒说明书操作。从平衡至室温的密封袋中取出实验所需板条，留空白孔。稀释适宜浓度后加样品于反应孔中，置于37 ℃孵育120 min。然后洗板5 次。于各反应孔中，加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液0.1 mL，37 ℃孵育1 h，洗板5 次。加酶结合工作液0.1 mL，37 ℃避光孵育30 min，洗板5 次。加入0.1 mL 显色底物液，37 ℃避光孵育15 min；于各反应孔中加入终止液0.1 mL，混匀后即可测量A450值。

3 统计学处理

所有数据采用GraphPad Prism 软件进行统计分析。数据采用均数±标准差（mean±SD）表示。两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 SENP3过表达抑制THP-1源性巨噬细胞泡沫化

Western blot 结果显示，pLenti-SENP3 组THP-1源性巨噬细胞SENP3 蛋白表达量约为pLenti-CT 组的6.38 倍，有显著增加（P＜0.05），提示稳定过表达SENP3 的细胞系构建成功，见图1A。油红O 染色结果显示，ox-LDL 刺激相较于mock 未刺激THP-1 源性巨噬细胞胞浆内有显著增多、变大的亮红色脂滴，呈典型泡沫细胞形态，表明ox-LDL 有效诱导巨噬细胞向泡沫细胞转化；ox-LDL 刺激后，与pLenti-CT 对照组比较，pLenti-SENP3 组THP-1 源性巨噬细胞胞浆内红色脂滴均显著减少、变小，泡沫细胞阳性率显著降低，见图1B。

2 SENP3 过表达抑制THP-1 源性巨噬细胞内脂质蓄积

Figure 1.Effect of SENP3 overexpression on foam cell formation from THP-1 macrophages.A：the expression level of SENP3 was assessed by Western blot analysis in pLenti-SENP3 and pLenti-CT groups；B：the number and volume of lipid droplets in cells were detected by oil red O staining（scale bar=50µm）.Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs pLenti-CT group.图1 SENP3过表达对THP-1源性巨噬细胞泡沫化的影响

与mock 未刺激细胞相比，经ox-LDL 刺激后pLenti-CT 组THP-1 源性巨噬细胞内TC 含量、CE 含量及CER 均显著升高（P＜0.01），FC 含量无显著差异，且CER 大于50%，提示THP-1 源性巨噬细胞经ox-LDL 刺激后泡沫细胞模型构建成功；在ox-LDL 刺激后，相对于pLenti-CT 组，pLenti-SENP3 组THP-1 源性巨噬细胞内TC 含量、CE 含量及CER 均显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），FC 含量无显著差异；而细胞未刺激时，SENP3 过表达组与对照组细胞各项数值均无显著差异，见表1。

表1 细胞内胆固醇含量Table 1.The levels of intracellular cholesterol（Mean±SD. n=3）

3 敲减SENP3促进RAW264.7巨噬细胞泡沫化

Western blot 结果显示，sh-SENP3 组RAW264.7巨噬细胞SENP3 蛋白表达量较sh-NC 对照组显著下降（P＜0.01），提示稳定敲减SENP3表达的细胞系构建成功，见图2A。油红O 染色结果显示，相较于mock 未处理组，ox-LDL 刺激后RAW264.7 巨噬细胞胞浆内有显著增多、变大的亮红色脂滴，呈典型泡沫细胞形态；ox-LDL 刺激后，与sh-NC 对照组比较，SENP3敲减表达后细胞胞浆内亮红色脂滴显著增多、变大，见图2B。

4 巨噬细胞泡沫化过程中SENP3表达量下降

Western blot 结果显示，与0 h 相比，THP-1 源性巨噬细胞中SENP3 的蛋白表达量在ox-LDL 刺激6 h时无显著差异（P＞0.05），而ox-LDL 刺激12 h 和24 h时SENP3 的蛋白表达量显著下降（P＜0.05 或P＜0.01），见图3。

5 巨噬细胞泡沫化过程中SENP3 过表达抑制procaspase-1的剪切

Western blot 结果显示，ox-LDL 刺激后，与pLenti-CT 组比较，SENP3 过表达组THP-1 源性巨噬细胞内pro-caspase-1 表达量无显著差异（P＞0.05），而剪切产生的caspase-1 剪切体（p20）的蛋白量显著下降（P＜0.01），见图4。

6 巨噬细胞泡沫化过程中SENP3 过表达抑制IL-1β的分泌

Figure 2.Effect of SENP3 knockdown on foam cell formation from RAW264.7 macrophages.A：the protein expression level of SENP3 was assessed by Western blot analysis in sh-SENP3 and sh-NC groups；B：the number and volume of lipid droplets in cells were detected by oil red O staining（scale bar=50µm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs sh-NC group.图2 敲减SENP3对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响

Figure 3.Changes of SENP3 expression level during foam cell formation from THP-1 macrophages.The protein expression level of SENP3 was assessed by Western blot.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h.图3 巨噬细胞泡沫化过程中SENP3蛋白表达量的变化

ELISA 结果显示，ox-LDL 刺激后，与plenti-CT 组比较，SENP3 过表达组THP-1 源性巨噬细胞分泌的IL-1β蛋白量显著减少（P＜0.05），见图5。

讨 论

巨噬细胞脂质代谢紊乱失衡和细胞泡沫化形成是加剧AS 发生发展的重要因素［12］。ox-LDL 是巨噬细胞泡沫化过程中胆固醇的主要来源，并且能够加剧胆固醇在巨噬细胞内沉积，转化形成泡沫细胞。泡沫细胞除了促使血管局部形成脂质池，加速AS 斑块形成外，还可以分泌大量细胞因子等炎症介质，促进斑块局部发生炎症反应，降低斑块稳定性，引起斑块破裂、脱落［13-14］。本研究使用100 mg/L 的ox-LDL刺激巨噬细胞24 h，通过油红O 染色显示模型组细胞内可见大量红色颗粒，表明细胞内存在大量脂质沉积和脂滴，符合泡沫细胞形态。同时，泡沫化的细胞内脂质蓄积增加，尤以CE 为主，一般CER 大于50%则认为符合泡沫细胞的改变，本研究中胆固醇含量测定结果显示模型组细胞中CER 为（62.7±1.3）%。两项实验结果都显示本研究泡沫细胞模型构建成功，从而模拟AS 病变过程中胆固醇沉积和泡沫细胞形成这一重要早期表征。

SENP3 作为SENPs 家族成员之一，其作用至关重要，国内外研究报道其在肿瘤增殖和转移中发挥重要作用，同时对神经疾病及心肌缺血再灌注也有影响，SENP3基因敲除可造成小鼠早期胚胎的死亡［15-16］。SENP3 与巨噬细胞泡沫化及AS 的关系此前未有报道，本研究中初次验证SENP3 对巨噬细胞泡沫化有显著抑制作用，在体外细胞实验水平上提供了SENP3 在AS 中可能发挥作用的证据，但是仍然缺乏更有依据的动物实验及临床研究。本课题组下一步拟通过小鼠尾部注射慢病毒sh-SENP3敲减SENP3表达，观察SENP3 对小鼠AS 疾病模型的影响，进一步探索SENP3是否有望成为治疗AS的潜在靶点。

Figure 4.Effect of SENP3 overexpression on caspase-1（Casp-1）cleavage during foam cell formation from THP-1 macrophages.The protein levels of SENP3，pro-Casp-1 and Casp-1（p20）were assessed by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs pLenti-CT ox-LDL group.图4 巨噬细胞泡沫化过程中SENP3过表达对caspase-1剪切的影响

Figure 5.Effect of SENP3 overexpression on IL-1β secretion during foam cell formation from THP-1 macrophages.The secretion of IL-1β in the cell culture supernatants was analyzed by ELISA.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs pLenti-CT ox-LDL group.图5 巨噬细胞泡沫化过程中SENP3 过表达对IL-1β 分泌的影响

胆固醇在细胞内以FC 及CE 两种形式存在，二者存在着动态平衡，多余的FC 将转化为CE 并储存于细胞内的脂滴中，从而避免过量的FC 对细胞造成损伤，减少CE 在胞内的沉积是抑制泡沫细胞形成的关键［17］。本研究中SENP3可显著降低巨噬细胞泡沫化过程中胞内TC 含量，对胞内CE 含量的抑制则更加显著，从而降低CER，但对于FC 含量没有显著影响，说明SENP3主要通过抑制CE 沉积抑制巨噬细胞泡沫化。

SENP3 在细胞内的浓度水平受ROS 的调控，少量的ROS 诱导SENP3 发生细胞内功能增强［5］，而大量的ROS 可造成SENP3 活性丧失［18］。本研究中SENP3 蛋白表达量随ox-LDL 刺激时间增加显著下降。大量ROS 造成SENP3 活性丧失，同时可以使LDL 发生氧化形成ox-LDL，ox-LDL 刺激则又可以抑制SENP3 的表达。在体内ROS 或ox-LDL 诱导的泡沫细胞形成过程中，SENP3 很有可能作为一种抑制性因子被下调表达或被抑制活性。

炎症小体的激活产生炎症因子IL-1β 和IL-18，由此造成的慢性炎症可以加速细胞泡沫化：IL-1β 通过抑制巨噬细胞内脂质分解代谢可促进泡沫细胞的形成［9］；抑制NLRP3炎症小体激活可以抑制巨噬细胞ox-LDL 的摄取，并增强胆固醇流出以减少泡沫细胞形成［19］；微小RNA-497-5p（microRNA-497-5p，miR-497-5p）下调NLRP1抑制巨噬细胞IL-1β 的分泌并促进胆固醇流出，从而抑制细胞泡沫化［20］。本课题组前期研究显示，SENP3可以通过特异性去SUMO化修饰NLRP3 而抑制炎症小体的激活和IL-1β 的产生［8］。本研究显示，SENP3 可以抑制巨噬细胞泡沫化过程中pro-caspase-1的剪切和IL-1β的分泌。于是我们提出如下假说：SENP3很可能利用其SUMO蛋白酶的活性，通过去SUMO化修饰NLRP3，抑制炎症小体激活，从而抑制巨噬细胞泡沫化。虽然炎症小体的激活主要是NLRP3 蛋白发挥作用，但受体蛋白也有可能是NLRP1和AIM2等多种蛋白，SENP3是否也可以通过去SUMO化修饰其他受体蛋白发挥作用，目前还不清楚。本研究不能确定具体是哪种炎症小体通路发挥作用，进一步可能需要检测巨噬细胞泡沫化过程中SENP3 对于几种受体蛋白的mRNA 水平、蛋白表达水平或SUMO化修饰水平的调控来验证。

综上所述，本研究表明SENP3 蛋白对巨噬细胞泡沫化有显著抑制作用，其作用机制可能通过抑制炎症小体的激活及促炎因子IL-1β 的释放。由于巨噬细胞泡沫化是AS 发生发展的关键因素，SENP3 可能是AS 发生发展的调控因子，有望成为防治AS 的潜在研究方向。