miRNA-218-5p通过HMGB1信号通路抑制RAW264.7细胞源性泡沫细胞炎症反应*

李海涛，蔡 飞，胡国富，滕云飞

（华中科技大学同济医学院附属协和医院，湖北武汉 430000）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是以血管内皮细胞损伤、慢性炎症、氧化应激失衡及脂质代谢障碍等为主要特征的慢性疾病［1］。在AS发展的初期进程中单核细胞通过向内膜迁移聚集以分化成巨噬细胞。氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）是AS 发生及发展进程中的关键因子，巨噬细胞通过其细胞膜上的跨膜蛋白如清道夫受体A（scavenger receptor-A，SR-A）、CD36等过度摄取ox-LDL，变成胆固醇负载的泡沫细胞［2］。泡沫细胞可以通过分泌炎症细胞因子如白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，增强局部炎症反应，促进斑块不稳定从而加重AS［3-4］。miRNA 是一种高度保守的长为20 个左右核苷酸序列的非编码单链小分子RNA，其能通过靶向mRNA 而介导基因转录后水平的调节。近年来大量文献证明，微小RNA（microRNA，miRNA）在AS 的发生发展进程中有着极其关键的作用［5］。miRNA-218-5p 与肺癌、宫颈癌、骨肉瘤、结肠癌及前列腺癌等癌症的发生紧密相关［6］。文献表明，miRNA-218-5p在AS患者外周血中的表达显著下降，可以作为AS 临床诊断的生物标志物［7-8］。但miRNA-218-5p 在AS 中的作用尚未有明确的阐述。高迁移率族盒蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一种DNA 结合蛋白，在炎症调节过程中有着极为关键的作用。研究表明，HMGB1 信号通路在AS 疾病中被异常激活，且通过调控炎症因子的表达而影响疾病的进展［9］。另外，我们通过生物信息学分析发现HMGB1 为miRNA-218-5p 的预测靶点。鉴于此，本研究通过构建RAW264.7 小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞模型探讨miRNA-218-5p 对泡沫细胞形成及HMGB1信号通路的影响。

材料和方法

1 细胞、试剂和仪器

RAW264.7 细胞（货号：CL-0190）购自武汉普诺赛公司。

miRNA-218-5p mimics、miRNA mimics control、HMGB1-3' 端非翻译区（3'-untranslated region，3'UTR）野生型（wild-type，WT）报告质粒及HMGB1-3'UTR 突变型（mutant，MUT）报告质粒均购自上海吉玛生物有限公司；Lipofectamin 2000 转染试剂（货号：11668027）购自Invitrogen；ox-LDL、蛋白提取试剂盒及BCA 蛋白浓度测定试剂盒（货号：IO1300、BC3711 和PC0020）均购自北京索莱宝生物有限公司；双萤光素酶报告基因检测试剂盒（货号：RG027）购自上海碧云天生物公司；小鼠IL-1β、IL-6 和TNFα ELISA 检测试剂盒（货号：CSB-E08054m、CSBE04639m 和CSB-E04741m）均购自武汉华美生物科技有限公司；兔抗小鼠GAPDH、HMGB1、Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 多克隆抗体（货号：10494-1-AP、10829-1-AP、19811-1-AP 和10745-1-AP）均购自武汉三鹰生物有限公司；兔抗小鼠p-NF-κB p65单克隆抗体（货号：3033）购自Cell Signaling Technology。

离心机购自Eppendorf；PCR 仪购自Applied Biosystems；超低温冰箱购自青岛海尔股份有限公司；CO2恒温培养箱购自Sanyo。

2 方法

2.1 细胞培养 RAW264.7 细胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM 培养液中生长，37 ℃、5%CO2、饱和湿度的孵育箱中培养。根据细胞生长情况2～3 d 传代1 次，用0.25%胰酶消化，取对数生长期生长状态良好的细胞进行实验。

2.2 细胞转染 将对数生长期的RAW264.7 细胞（1×106个）接种于6 孔板中，细胞生长密度至70%～90%时，根据Lipofectamine 2000 说明书分别转染miRNA-218-5p mimics及miRNA mimics control。

2.3 油红O 染色 实验分为4 组：对照组、模型组、miRNA mimics 组及miRNA NC 组。对照组细胞正常培养；模型组细胞采用80 mg/L ox-LDL 诱导24 h 建立泡沫细胞模型；miRNA mimics 组及miRNA NC 组分别转染miRNA-218-5p mimics 及miRNA mimics control 24 h 后再用80 mg/L ox-LDL 诱导24 h 建立泡沫细胞模型。将细胞接种在铺有盖玻片的6 孔板中，ox-LDL 诱导处理细胞24 h 后除去培养液，用PBS冲洗细胞后4%多聚甲醛固定10 min，用新鲜配制的油红O染液室温下孵育15 min后，PBS冲洗后甘油封片，显微镜下观察拍照。

2.4 ELISA 试剂盒检测IL-1β、IL-6 及TNF-α 表达量 ox-LDL 诱导处理细胞24 h 后收集各组细胞，分别采用IL-1β、IL-6 及TNF-α 的ELISA 试剂盒检测细胞中相应细胞因子的表达水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2.5 qPCR 检测 ox-LDL 诱导处理细胞24 h后收集各组细胞，按照TRIzol 试剂盒中说明书的步骤提取样本总RNA，通过逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA。miRNA-218-5p 的上游引物序列为5'-GCCGAGTTGTGCTTGATCTAA-3'，下游引物序列为5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；内参照U6 的上游引物序列为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。qPCR的总体积为20µL：10µL 的PCR 预混液，上、下游引物各0.8 µL，7.4 µL 的超纯水，1.0 µL 的模板。采用三步法进行qPCR，具体如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 个循环。每个样品做3 次重复检测。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达情况。

2.6 Western blot 检测 ox-LDL 诱导处理细胞24 h后收集对照组、模型组、miRNA mimics 组及miRNA NC 组细胞，根据蛋白提取试剂盒步骤提取细胞总蛋白。然后定量30 µg 进行SDS-PAGE，转移至PVDF膜上，采用5%脱脂奶粉室温下封闭2 h，加入Ⅰ抗（GAPDH 抗体，1∶10 000 稀释；HMGB1 抗体，1∶500稀释；TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65抗体，1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜，TBST 清洗3 次后，加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗（1∶5 000 稀释），室温下孵育2 h，TBST清洗4次。加入ECL化学发光显影后扫描胶片，采用ImageJ 软件分析蛋白条带灰度。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带的灰度值/内参照GAPDH条带的灰度值。

2.7 双萤光素酶实验 实验分为4 组：HMGB1-3'UTR-WT+miRNA NC 组（RAW264.7 细胞共转染HMGB1-3'UTR-WT 报告质粒和miRNA mimics control）、HMGB1-3'UTR-WT+miRNA-218-5p mimics 组（RAW264.7 细胞共转染HMGB1-3'UTR-WT 报告质粒和miRNA-218-5p mimics）、HMGB1-3'UTR-MUT+miRNA NC组（RAW264.7细胞共转染HMGB1-3'UTRMUT 报告质粒和miRNA mimics control）和HMGB1-3'UTR-MUT+miRNA-218-5p mimics组（RAW264.7细胞共转染HMGB1-3'UTR-MUT 报告质粒和miRNA-218-5p mimics）。转染48 h 后参照双萤光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作步骤进行检测，计算萤光素酶相对活性（萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶）。

3 统计学处理

通过SPSS 17.0 软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 油红O 染色观察各组RAW264.7 细胞内脂质变化

油红O 染色结果显示，与对照组相比，模型组RAW264.7 细胞经过80 mg/L 的ox-LDL 诱导24 h 后可见细胞中存在大量红色脂滴，表明成功建立了RAW264.7 细胞源性泡沫细胞模型；与模型组相比，miRNA mimics组RAW264.7细胞源性泡沫细胞内脂滴染色较淡，见图1。

Figure 1.Changes of intracellular lipids in RAW264.7 cell-derived foam cells of each group（oil red O staining，×400）.图1 各组RAW264.7细胞源性泡沫细胞内脂质变化

2 ELISA 试剂盒检测各组细胞中IL-1β、IL-6 及TNF-α表达量

与对照组相比，模型组RAW264.7 细胞中IL-1β、IL-6及TNF-α 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，miRNA mimics 组RAW264.7 细胞中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平显著降低（P＜0.05），而miRNA NC 组RAW264.7 细胞中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平无显著变化（P＞0.05），见图2。

3 qPCR检测各组细胞中miRNA-218-5p的表达

与对照组相比，模型组RAW264.7 细胞中miRNA-218-5p 表达水平均显著下降（P＜0.05）；与模型组相比，miRNA mimics 组RAW264.7细胞中miRNA-218-5p表达水平显著上升（P＜0.05），而miRNA NC 组RAW264.7 细胞中miRNA-218-5p 表达水平无显著变化（P＞0.05），见图3。

Figure 2.Changes of IL-1β，IL-6 and TNF-α expression levels in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.图2 各组细胞中IL-1β、IL-6及TNF-α表达量变化

Figure 3.Changes of miRNA-218-5p expression in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.图3 各组细胞中miRNA-218-5p表达量变化

4 Western blot 检测各组细胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白水平

与对照组相比，模型组RAW264.7 细胞中HMGB1、TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白水平均显著升高（P＜0.05），NF-κB p65 无显著变化（P＞0.05）；与模型组相比，miRNA mimics 组RAW264.7 细胞中HMGB1、TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白水平均显著降低（P＜0.05），NF-κB p65无显著变化（P＞0.05），而miRNA NC 组RAW264.7 细胞中HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65 和NF-κB p65 蛋白水平均无显著变化（P＞0.05），见图4。

Figure 4.The protein levels of HMGB1，TLR4，NF-κB p65 and p-NF-κB p65 in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.图4 各组细胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65 和p-NF-κB p65蛋白水平的变化

5 双萤光素酶报告基因实验检测miRNA-218-5p对HMGB1的靶向作用

经TargetScan（http：//www.targetscan.org/）预测，HMGB1-3'UTR 具有miRNA-218-5p 高度保守的结合位点，见图5A。双萤光素酶报告基因实验结果显示，与HMGB1-3'UTR-WT+miRNA NC 组相比，HMGB1-3'UTR-WT+miRNA-218-5p mimics 组萤光素酶活性显著下降（P＜0.05），而HMGB1-3'UTR MUT+miRNA NC 组与HMGB1-3'UTR MUT+miRNA-218-5p mimics 组中萤光素酶活性无显著变化（P＞0.05），见图5B。

讨 论

Figure 5.Targeting relationship between miRNA-218-5p and HMGB1.A：TargetScan prediction result；B：relative luciferase activity in RAW264.7 cells of each group.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs miRNA NC group.图5 miRNA-218-5p对HMGB1的靶向作用

AS 是一种常见的慢性疾病，主要特点为动脉血管管腔在粥状脂质斑块沉积作用下变窄引起血流不畅，最终造成起下游组织缺血性损伤。AS 不仅直接危害机体健康，还能引发动脉瘤，主动脉夹层以及冠状动脉疾病等一系列高危疾病，具有较高的发病率及致死率，而且治疗难度大，治疗成本高［10］。随着人们生活水平的逐渐提高，中老年人对于高脂食物的过量摄入，使AS 己成为中老年人容易患病的主要疾病之一。据文献报道，2020年全球颈AS预估有近20亿人，而估算我国可能有近2.7 亿的患者，而且呈逐年上升的趋势［11］。目前，临床上对于AS 的治疗一般通过调节机体反应降低体内血脂水平为主，治疗药物种类一般分为他汀类、烟酸类、贝特类及胆酸螯合剂类药物等。这类药物虽然对AS 具有一定的治疗作用，但是也存在许多副作用，如损伤肝脏功能、导致胃肠道消化不良、过敏反应等［12］。因此寻找开发AS 疾病中的新型有效治疗靶点极其重要。miRNA是近年来研究非常热门的非编码单链小分子RNA，miRNA 能通过与其相应mRNA 靶标碱基配对从而引导沉默复合体以降解mRNA 或阻止其翻译的方式导致mRNA 沉默［13］。大量研究者证实，miRNA 影响着AS 的进程及其可以作为诊治AS 疾病中的靶点［14］。文献表明，miRNA-218-5p在AS临床患者外周血中表达显著下降，其可以作为AS 临床诊断的生物标志物［7-8］。本研究中通过qPCR 结果也发现在ox-LDL 诱导的RAW264.7 细胞源性泡沫细胞中miRNA-218-5p表达水平下降。另外本研究中油红O 染色结果表明提高miRNA-218-5p 表达水平能抑制RAW264.7细胞源性泡沫细胞形成。而巨噬源性泡沫细胞的形成是AS 疾病进程的初始环节。在AS 疾病初期，巨噬细胞通过大量摄取ox-LDL 形成了泡沫细胞，后期泡沫细胞的过度沉积能导致AS 初期形状不规则病理脂质条纹的出现，从而导致脂质斑块的形成［3］。所以miRNA-218-5p 能抑制泡沫细胞形成可作为其能防止AS发生发展的重要手段。

自Ross提出AS的炎症学说以来，炎症反应已被证实于AS 的发病机制中至关重要。大量研究文献证明AS病灶处有大量炎症因子存在，进而推进了AS的发展进程［15］。HMGB1 炎症通路于炎症刺激和调节中有着极为关键的作用［16］。HMGB1 是一种高度保守的核DNA 结合蛋白，在细胞核中作为转录因子调控下游基因的转录表达。同时HMGB1 也是损伤相关模式分子家族主要成员之一，可从免疫细胞自主分泌或从损伤的细胞被动转移到胞浆或胞外，通过作用于细胞膜上晚期糖基化终末产物受体和Toll样受体如TLR4的激活完成信号传导过程，这些激活的受体能进而引发NF-κB 的活化从而诱导炎症反应［17-18］。近年来大量文献证实HMGB1信号通路介导了AS疾病的进展。de Souza 等［19］的研究表明，HMGB1 在AS 病变组织的巨噬细胞和平滑肌细胞中表达显著增加，并与AS 脂质斑块的形成有关。Xiao等［20］的研究表明，对ApoE基因敲除的AS小鼠给予丙酮酸乙酯治疗能阻断HMGB1 的表达进而减少其下游炎症因子表达，从而抑制小鼠AS 的发展进程。Li等［21］的研究表明，HMGB1 是miR-141-5p的靶标，miR-141-5p 通过靶向HMGB1 通路抑制AS 中血管平滑肌细胞的炎症、增殖和迁移。所以，针对HMGB1炎症途径可能是诊治AS 疾病的有效策略。本研究中，通过miRNA-218-5p mimics 提高RAW264.7 细胞源性泡沫细胞中miRNA-218-5p 表达水平能抑制HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65、IL-1β、IL-6 及TNF-α 表达，同时双萤光素酶报告基因实验也表明了miRNA-218-5p 能直接靶向结合HMGB1 的3'UTR 从而调控其表达。上述结果提示，RAW264.7 细胞源性泡沫细胞中HMGB1 通路被激活，而miRNA-218-5p 可抑制HMGB1 通路激活，进而减少RAW264.7 细胞源性泡沫细胞IL-1β、IL-6及TNF-α等炎症因子分泌。

综上所述，miRNA-218-5p 可以抑制RAW264.7细胞源性泡沫细胞的形成，调节HMGB1通路减少炎症因子分泌，减轻细胞炎症反应，对防治AS 疾病有重要的意义。