红托竹荪菌托多糖浓缩及醇沉工艺研究

敖珍，覃发玠，罗迎春，龙俊训，向瑞琪，方开铸，刘杨，谭红,5*

(1.贵州民族大学 化学工程学院，贵阳 550025；2.贵州省工程复合材料中心，贵阳 550016；3.贵州医科大学 公共卫生学院，贵阳 550025；4.贵州科学院，贵阳 550001；5.贵州省分析测试研究院，贵阳 550014；6.贵阳人文科技学院校团委，贵阳 550025)

多糖大多数来自于植物[1-5]，具有明显的生物活性，营养价值丰富。其中食用菌多糖有多种生理活性及保健功能[6-8]，被广泛应用于医药、食品、生物等领域。我国食用菌资源丰富，产值极高，常以简单干品、腌制品、罐头为主要商品形式[9-10]，近年来，以食用菌为原料的保健食品也出现在公众视野中，如功能醋[11]、营养酱[12]等。红托竹荪是珍贵的大型药食两用的真菌[13-14]，由菌盖、菌柄、菌托组成。生产者常常将菌托作为废弃物丢掉，造成极大的浪费[15]，但红托竹荪菌托多糖具有明显的生物活性，是一种极具开发价值的天然保健品，也可成为味道可口的功能性调味食品。若能够将其丰富的营养价值利用起来，变废为宝，不仅能促进人类健康，还能保护环境，促进资源利用。

目前，大多数文献报道集中在红托竹荪菌托的提取工艺方面[16-18]，对红托竹荪菌托的浓缩及醇沉工艺的研究却鲜见报道。因此，本试验探讨红托竹荪菌托多糖的浓缩及醇沉工艺，为红托竹荪菌托多糖的进一步精深加工及高效提取提供了依据，同时也为多糖成为营养丰富、美味可口的功能性调味食品提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

红托竹荪菌托：贵州金蟾大山生物科技有限公司。

1.2 试剂

95%食品级乙醇：贵阳金精化工厂；苯酚、硫酸、无水葡萄糖：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；蒸馏水：贵州省分析测试研究院制。

1.3 主要仪器与设备

药材粉碎机、回流提取罐、单联过滤器、单效浓缩器、刮板浓缩器 上海成界制药设备有限公司；冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；723S可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；电子天平 沙鹰科学仪器有限公司；电加热套 天津工业实验室仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 红托竹荪菌托多糖的测定

参考NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的测定》方法，采用苯酚-硫酸法测定红托竹荪菌托多糖的含量。配制0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液，分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于具塞试管中，分别用蒸馏水补至1.0 mL，再加入1.0 mL苯酚、5.0 mL浓硫酸，静置10 min后，涡旋混合，于30 ℃恒温水浴30 min后用可见分光光度计测定吸光度值。以葡萄糖含量为横坐标(X)、吸光度值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，回归方程为Y=11.478X+0.00168，相关系数R2=0.9993。

取1.0 mL样品溶液按上述方法测定吸光度值，求其含量，按公式(1)计算多糖提取率。

(1)

式中：c为所测红托竹荪菌托多糖含量，mg/mL；V为多糖定容体积，L；N为稀释倍数；m为原料质量，g。

1.4.2 红托竹荪菌托多糖浓缩液的制备

浓缩液的制备在贵州科学院中试设备上完成。将红托竹荪菌托进行除杂后,准确称量3.0 kg原料于300 L回流提取罐中，采用热水浸提[19]方法以1∶30(kg/L)加入纯化水，在85 ℃下提取2 h，2次，真空管道抽滤，于储存罐中合并滤液，在单效浓缩器中浓缩至原提取液体积的1/3，再由刮板浓缩器浓缩至单效浓缩液体积的1/3，将所得浓缩液置于4 ℃冰箱中，保存备用。

1.4.3 单因素试验

1.4.3.1 浓缩比(原料质量∶浓缩液体积)对红托竹荪菌托多糖提取率的影响

称取5份红托竹荪菌托粉末3.0 g于圆底烧瓶中，按1∶25(g/mL)加入蒸馏水，使用电加热套在85 ℃条件下冷凝回流提取2 h，2次，抽滤，收集滤液，滤液进行浓缩(浓缩比(g/mL)分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)，浓缩后分别加入4倍体积的95%乙醇，静置12 h，离心，收集多糖沉淀，加入热水溶解，定容，取1.0 mL采用苯酚-硫酸法测多糖含量，计算提取率，平行试验3次。

1.4.3.2 红托竹荪菌托多糖的分步醇沉

参考耿安静等[20]醇沉香菇多糖的方法进行红托竹荪菌托多糖的分步醇沉。取1.4.2所制备的多糖浓缩液153 mL，加入乙醇调节乙醇体积分数为10%，醇沉12 h，收集沉淀，上清液再加入乙醇，调节乙醇体积分数为20%，醇沉12 h，收集沉淀，上清液继续加入乙醇，调节至30%，依此类推，直到上清液乙醇体积分数调节至90%。将各体积分数的沉淀冻干，称量，得红托竹荪菌托多糖质量。

1.4.3.3 红托竹荪菌托多糖的其他醇沉工艺

取1.4.2中制备的多糖浓缩液39份(每份30 mL)，以多糖质量为指标，分别探究醇沉时间(0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，7，8，9，10，11，12，14，16，18，21，24，30，36 h)、乙醇浓度(55%、65%、75%、85%、95%)、加入的乙醇倍数(1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5倍)对红托竹荪菌托多糖沉淀的影响。探究醇沉时间时，按公式(2)分析多糖醇沉速度。

(2)

1.4.4 正交优化试验

根据探究醇沉工艺对红托竹荪菌托多糖沉淀影响的单因素结果，取1.4.2中制备的浓缩液9份(每份100 mL)，选取醇沉时间、乙醇浓度、乙醇体积倍数为试验因素，设计L9(33)正交试验，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平设计

1.5 数据处理

试验数据采用 OriginPro 9.0 绘图，采用正交设计助手II V3.1专业版进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 浓缩比对红托竹荪菌托多糖提取率的影响

由图1可知，随着浓缩比的逐渐减小，红托竹荪菌托多糖提取率先升高后降低，在浓缩比为1∶2(g/mL)时，多糖提取率最高。因此，浓缩比选择1∶2(g/mL)为宜。

图1 浓缩比对多糖提取率的影响

2.1.2 分步醇沉对红托竹荪菌托多糖沉淀的影响

由图2可知，分步醇沉时，乙醇体积分数对多糖质量的影响较大，尤其是乙醇体积分数在40%时，得到的红托竹荪菌托多糖的质量最大，其质量占整个分步醇沉质量的36.4%。因此，在采用分步醇沉时，建议采用40%及以上的乙醇体积分数进行醇沉。

图2 多糖的分步醇沉

2.1.3 醇沉时间对红托竹荪菌托多糖沉淀的影响

由图3可知，醇沉时间对多糖质量无明显影响。

图3 多糖的不同时间醇沉

由图4可知，醇沉速度随着醇沉时间的增加逐渐降低，醇沉速度开始很大，随着时间的延长，醇沉速度迅速下降之后逐渐减小，大约在5 h后趋于平缓。

图4 多糖的醇沉速度

2.1.4 乙醇浓度对红托竹荪菌托多糖沉淀的影响

由图5可知，随着乙醇浓度的增加，红托竹荪菌托多糖质量呈线性上升，乙醇浓度95%所醇沉的多糖质量是乙醇浓度55%的4.29倍，是乙醇浓度65%的2.43倍，是乙醇浓度75%的1.49倍，是乙醇浓度85%的1.18倍，由此可以看出，若想得到最大的多糖质量，需用高浓度乙醇进行醇沉。

图5 多糖的不同乙醇浓度醇沉

由图6可知，选用乙醇浓度55%时，烧杯中为浓缩液与絮状的混合物，多糖絮状沉淀没有完全沉淀在烧杯底部，说明大部分多糖还保留在浓缩液中，沉淀不完全；乙醇浓度65%、75%、85%的沉淀呈絮状物析出，但乙醇浓度65%、75%比乙醇浓度85%醇沉的沉淀析出少，当选用乙醇浓度95%时，多糖沉淀呈小颗粒状而非絮状，析出在烧杯底部，且上清液明显比低浓度的乙醇更清亮，说明多糖几乎完全作为沉淀析出。

图6 多糖的不同乙醇浓度醇沉试验图

2.1.5 乙醇体积倍数对红托竹荪菌托多糖沉淀的影响

由图7可知，乙醇体积倍数在4倍以下时，多糖的沉淀质量呈上升趋势，当乙醇体积倍数较小时，所得多糖质量较小，在较大乙醇体积倍数时，多糖质量差距不明显，说明多糖已完全析出。综合考虑多糖析出及成本问题，选择加入3～4倍体积乙醇比较适宜。

图7 多糖的不同乙醇体积倍数醇沉

2.2 正交试验结果及分析

2.2.1 正交试验结果

由表2的极差分析结果可知，醇沉工艺对红托竹荪菌托多糖沉淀的影响大小顺序为C>B>A，即乙醇体积倍数>乙醇浓度>醇沉时间，醇沉时间对多糖沉淀的影响最小，并且可以得出C3>C2>C1，B2>B3>B1，A3>A1>A2，因此最优组合为C3B2A3。

表2 正交试验结果

2.2.2 方差分析

由表3的方差分析结果可知，在显著水平P=0.05时，乙醇浓度与乙醇体积倍数对多糖的质量影响较大，达到了显著水平，结合表2和表3的结果，醇沉时间对多糖质量的影响不明显，本着高效、省时的原则，确定A1为A因素的最佳水平。

表3 方差分析结果

综上分析，醇沉红托竹荪菌托多糖的最佳醇沉工艺条件组合为A1B2C3，即醇沉时间2 h,乙醇浓度85%,加入乙醇体积倍数为4倍。

2.2.3 验证试验

由于正交试验优化的最佳醇沉条件A1B2C3不在正交设计表中，为检验最佳醇沉条件的可靠性，需进行验证试验，平行3次取其平均值，红托竹荪菌托多糖质量为3.12 g，显著高于其他醇沉条件下的红托竹荪菌托多糖质量。

3 结论

本试验对红托竹荪菌托多糖的醇沉工艺进行了研究，为红托竹荪菌托多糖的提取提供了理论依据，单因素试验中，浓缩比为1∶2(g/mL)时所得多糖质量最大，正交试验中，得出最佳醇沉条件为：醇沉时间2 h，乙醇浓度85%，加入乙醇体积倍数为4倍。通过本工艺研究，多糖得率能明显提高，为红托竹荪菌托多糖的开发利用提供了工艺参考，促进了红托竹荪菌托的废物利用，获得更多有用的资源。