质控品在食品微生物检测中的制备及应用

齐程田，张亮，刘云国

(1.新疆大学 生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830002；2.临沂大学 生命科学学院，山东 临沂 276000；3.临沂小鲁生物科技有限公司，山东 临沂 276000)

在近些年的食物中毒患者中，食源性致病微生物引发的食物中毒人数占总体的70%。因食品微生物污染比其他类型的食品污染更严重、致死率更高[1]，食源性致病微生物给人类带来的生命财产安全损失已然成为一个全球化的公共卫生问题。在食品生产加工的各个环节都有致病微生物侵染的风险,Nascimento等[2]分别以采摘后、二次加工和流入市场的花生及花生加工制品作为样本进行跟踪检测。结果显示：采后样品中肠杆菌科(Enterobacteriaceae)数量较高；二次加工结束后，16%的样品仍含有该菌。此外，该团队还检测到花生在供应链的不同阶段会受到沙门氏菌的污染。Forero等[3]选取哥伦比亚食源性疾病通报最多和最少的学校餐厅进行抽样,主要以餐厅的大米、即食谷物、面粉和淀粉中的蜡样芽孢杆菌含量为检测指标。结果表明，在学校餐厅收集到的479份样本中9%对蜡样芽孢杆菌呈阳性反应,纠察原因是原料处理和食品热处理不当导致的。此外，叶丹等[4]研究发现致病微生物在香辛料的种植、收获、加工、存储过程等多个环节都会存在污染，如黑胡椒中的沙门氏菌、辣椒中的黄曲霉菌、赭曲霉菌等。因此，对于食品微生物的检测要贯穿各个方面，对食源性致病菌的检测与防控需要严格把控。

我国食品标准对于微生物指标贯穿于食品加工生产的各个环节，判断食品企业在生产经营上能否达到标准，食品企业或检验机构具有对致病微生物检得出和检得准一直受到各界关注[5]。质控品作为给被测样本赋值的标尺，是检测数据准确性的决定因素。本文通过介绍当前质控品在食源性致病菌检测中的研究现状、关键步骤和应用场景，以期加强各界对于食品质控品的深入理解，从而提高食源性致病微生物检测技术，为微生物检测的精度提供参考。当前食品微生物质控品主要包扩标准菌株、定量质控样品、核酸水平质控品三大类。

1 标准菌株

GB/T 27405-2008《实验室质量控制规范 食品微生物检测》[6]中规定，标准菌株是一类具有溯源性的菌株，通常由专业的菌种保藏机构或权威机构保存下发。标准菌株是微生物检测过程的关键指示剂，作为内部质量控制的一部分，贯穿了食品微生物检测的各个环节。因其具有良好的稳定性和溯源性，在食源性致病微生物检测新方法确认、实验室新进培养基和试剂的测试、仪器设备功能检测、人员及实验室能力验证等方面可起到内部质量控制作用，为保证检测结果的准确性和提高微生物检测技术起到了关键作用。

在国标4789系列中明确规定，在检测食源性致病微生物过程中应将标准菌株作为阴性和阳性对照物。如：一些常见的食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、天然矿泉水中粪链球菌等微生物的检验。需要同时培养标准菌株作为阳性对照，目的是控制相同的检测条件和检验过程，得出实验偏差，验证检验结果的准确性，从而有效引导微生物报告的分析和判断[7]。除了作为阳性对照，标准菌株在食品生产过程中还可以起到指示剂的作用。以嗜热脂肪芽孢杆菌为例，该菌可以检验压力灭菌装置的灭菌效果，Elanda Fikri等[8]以嗜热脂肪芽孢杆菌数量差异为指标，可以确定医疗废物回收过程中氯消毒剂剂量。李雅丽等[9]研究发现，该菌在同等温度、同等基质中有稳定的耐热性、重现性好的D值，因此可作为低酸性饮料杀菌指示菌。类似的菌还有很多，例如：紫外线表面灭菌效果通常用大肠杆菌[10]、枯草芽孢杆菌作为指示菌株。在培养一些严格厌氧的菌株时，对于厌氧培养箱的性能要求较高。通过观察一些严格厌氧的标准菌株(如生孢梭菌、黑色拟杆菌等)的生长情况，可用于验证厌氧培养箱的性能。

2 质控样品

2.1 质控样品研究进展

质控样品是一种具有标准值和不确定度的标准样品。当前我国对于质控样品的研制分为两个方面：一种是不加入基质的质控样品。该质控样品可以直接用于实验室内部质量控制、实验方法可行性的确认等。张彬彬等[11]所制备的阪崎肠杆菌质控样品在4 ℃冷藏条件下可保存28 d，且均匀性好、稳定性高；随着对质控样品研究技术的深入，薛蕾等[12]将大肠杆菌与奶粉、海藻糖等多种保护剂混合后经冷冻干燥制备成可稳定保存半年的质控样品。孙晓霞等[13]研制的单核细胞增生李斯特氏菌质控样品与冻干保护剂混合后冻干存活率达到77.78%，制备后210 d仍具有稳定性。另一种质控样品是含有基质的质控样品，根据GB/T 27405-2008《实验室质量控制规范 食品微生物检测》中规定，为反映在检测过程中的实际检测状况，可以通过使用自然污染产品或人工污染的微生物样品来实现。向基质中添加预定微生物作为当前最佳的方法，研究人员将确定浓度的菌液和冷冻干燥保护剂加入到了不同的基质中。陈彬等[14]在奶液中添加已知浓度的阪崎肠杆菌，将混合液真空冷冻干燥后制备成基质为冻干奶粉的定量质控样品。林杰等[15]以鱼肉粉作为基质，按一定的比例添加混合保护剂，同时添加一定浓度的菌液，制备成均匀性良好的定量质控品。曹文博等[16]以冻干的绿豆粉为基质，脱脂奶粉为冻干保护剂，将菌悬液与保护剂混匀，通过真空冷冻干燥分别制备出沙门氏菌能力验证阳性质控样品与阴性质控样品，建立有效的沙门氏菌能力验证质控品。

2.2 质控样品的制备关键步骤

质控样品的基本制备流程为：将食源性致病菌标准菌株划线接种于最适细菌培养基上，根据菌株特性培养相应的时间，挑取单菌落进行理化检测确定纯度。验证纯度后配制一定浓度的菌悬液，选取该菌合适的冻干保护剂与基质，进行冷冻干燥得到成品，并对其均匀性、稳定性[17]进行验证。然而根据文献得知定量质控样品的关键步骤在于冷冻干燥环节保护剂的选择。一种好的保护剂不仅可以提高微生物的存活率，而且可以提高质控样品的均匀性、稳定性。

在质控样品的制备过程中，菌体的存活率作为关键指标。冷冻干燥是最常用的物质保存方法之一，然而，在冷冻干燥过程中会对所冻干的物质的细胞组织结构造成损伤[18]。在此过程中，低温保护剂可以大大减少细胞损伤，所采取的冻干保护剂的差异对不同菌株的存活率是不同的。一般情况下，较为容易保存的菌种对保护剂的要求不是很高。在冷冻干燥过程中，往往根据菌株的种类对保护剂加以选择。

Wang等[19]探讨了大分子冷冻干燥保护剂及其组合冻干保护剂维持细菌活性的可能性。单独加入大豆多糖对乳酸菌AR113冷冻干燥后的存活率比海藻糖高19%。此外，添加大豆多糖和海藻糖复合冷冻保护剂的植物乳杆菌WCFS1冻干后存活率为90.52%，较单独添加海藻糖和大豆多糖的存活率分别提高了31.48%和36.47%。研究表明，复合低温保护剂是通过改善细胞膜完整性和乳酸脱氢酶活性来提高乳酸菌的存活率。Chen等[20]采用响应面法(RSM)和中心组合设计(CCD)优化了双歧杆菌BB01的冻干保护剂。该研究对双歧杆菌BB01在不同保护剂条件下的冻干存活率和冻干粉单位重量活菌数进行了研究。优化后的冷冻保护剂为:甘氨酸5.5%，碳酸氢钠0.8%，低聚木糖7%，精氨酸4.5%，脱脂牛奶25%。存活率与预测值(88.58%)接近。研究表明，RSM可以成功地优化双歧杆菌冻干粉的复合冷冻保护剂，原因是保护剂对益生菌细胞起到了保护作用。陈胜杰等[21]采用真空冷冻干燥法，分别以植物乳杆菌SC1、凝结芽孢杆菌XP2、酿酒酵母菌SA1为实验菌株，研究冻干保护剂脱脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC钠盐对3种益生菌冻干存活率的影响，确定添加最优保护剂组合，3株菌的冻干存活率分别为83.2%、83.7%和86.7%，活菌数均高于1.0×108CFU/g，具有较好的应用价值。

2.3 质控样品的应用

当前质控样品应用于多种场景：如实验室和科研院所的培养基和试剂的验收、实验室检测能力认证、检测方法确认与验证、检测过程中的阳对照、阴对照、新员工培训考核和能力评价等，因以标准菌株为制备质控样品的原料，检测结果具有可追溯性。制备质控样品是将已知量的待测食源性致病微生物加入到各种生物介质中配制而成，通过多种检验定值，因而具有可溯源性[22]。《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》中规定，对于微生物定量检测项目，应该定期使用有证标准物质或标准样品(如菌落总数标准物质等)进行监控，或使用质控样品开展内部质量控制活动，因此质控样品对于微生物检测意义重大。

3 分子水平质控品

3.1 分子水平质控品的研究进展

分子水平质控品包含很多种[23]，如基因组DNA、含目标基因DNA片段的质粒、RNA全病毒。在食品分子水平检测过程中，含有目标基因DNA片段的质粒应用范围广、适用场景多。快速识别和诊断食源性致病菌对食品工业的发展以及食品安全具有很大的意义。但当前食源性致病菌的检验大多数为传统检测，耗时较长、检测限低、操作复杂，不能快速鉴别致病菌。当暴发食物中毒事件时，若不能准确、快速确定病原菌，必然会造成无法估量的损失。

质粒 DNA质控品是一种被导入食源性致病微生物特异性片段的质粒，在PCR定性检测中可作为阳性参考物质，在 PCR 定量分析中又可作为标准物，可构建出定量分析的标准曲线。当前，质粒 DNA质控品作为基因检测的标准物质受到了广泛关注，这是因为聚合酶链式反应(PCR)等核酸检测技术的应用在一定程度上规避了传统检测方法的弊端[24]。通过构建含有致病菌毒力基因的重组质粒，从而快速检测食源性致病菌。许丽等[25]利用了阪崎肠杆菌PCR检测的特异性片段(MMS、ITS、16S rDNA、ompA)，其研制的质粒DNA标准物质可以替代基因组DNA 对阪崎肠杆菌进行检测,大大提高了检测效率和准确性。Vallejo等[26]制备了两种DNA浓度，并根据PCR反应和肠炎沙门氏菌基因靶标invA、ttr和hilA进行的表达、测定均匀性和稳定性研究的结果作为其不确定度的参考值，该质控品可在4 ℃下稳定保存9个月。夏丹丹等[27]以大肠杆菌的毒力基因escV、stx2和hlyA为靶标序列构建DNA质粒质控品，通过菌落PCR和序列测定对所构建的重组质粒进行验证，证明了质控样品可用于快速检测食物中的大肠杆菌。随着分子生物学技术的发展，定量聚合酶链反应[28](qPCR)方法现在广泛用于RNA和DNA目标序列拷贝的绝对定量，广泛应用于各种检测场景。获得这些定量目标序列拷贝估计数的最常见方法之一是使用核酸标准物质(如DNA标准品)的qPCR周期阈值(Ct)测量生成的标准曲线。Mano等[29]对粪便指示菌(FIB)快速qPCR方法进行了研究，并开发了标准参考物质，以便将分析结果与EPA水质标准值进行比较，同时促进了实验室内部和实验室之间的比较。努色热提·阿布都沙拉木等[30]将沙门氏菌检测和分型常用的se、st、aceA等作为目标序列，将其DNA片段克隆到PUC57质粒中，构建pDNA沙门氏菌质粒对照物质，并对该质粒质控品进行了定量检测，以及对其稳定性和均匀性进行了评价，实现了利用实时定量PCR技术检验沙门氏菌从而代替基因组DNA的检测。该质粒质控品具有序列准确和可追溯等特点，该研究证明了快速合成的质粒可以作为鉴定伤寒沙门氏菌 qPCR 质控品。

3.2 分子水平质控品的制备关键步骤

提取食源性微生物标准菌株的全基因组DNA，以此作为模板用合成的引物(内含特异性基因片段或毒力基因)进行扩增，扩增后将目的片段进行回收；将回收的各个基因片段克隆至载体上，以此构建出含有基因的重组质粒；应用PCR和测序对重组质粒进行验证，将转化成功的重组质粒进行质粒提取并保存，将提取的质粒制成冻干粉，即初步得到用于检测的食源性菌的DNA质控品。对含有毒力基因的质粒标准物质的纯度、浓度以及准确性进行检验，并按照《ISO导则35标准样品定值的一般原则和统计方法》的要求检测DNA质控品的均匀性、稳定性(短期稳定性、长期稳定性)以及与多家实验室合作对其进行定值。定值后通过均匀性、稳定性等性质确定质控品的不确定度。

在分子水平质控品的制备过程中，确定食源性致病菌的特异性基因片段或毒力基因是技术的关键。这是因为一些基因虽然具有特异性，但不适合作为质粒标准物质的基因。以食品中的肠出血性大肠杆菌(EHEC)为例，检测该细菌的方法一直具有挑战性。以往对肠出血性大肠杆菌以主要毒力基因stx1、stx2、eae和o血清群特异性基因进行PCR检测，但不能特异性地鉴定出肠出血性大肠杆菌株。Delannoy等[31]从OI-57基因组中鉴定出两个基因(Z2098和Z2099)，该基因与肠出血性大肠杆菌及其stx阴性衍生株密切相关(Z2098相关率为87%，Z2099相关率为91%)。因此Z2098和Z2099是更有针对性地诊断典型肠出血性大肠杆菌和新型肠出血性大肠杆菌的有效基因标记物。又如志贺氏菌，以往用来快速检测志贺氏菌的基因一般为ipaH基因、ial基因、vir基因等，由于后两种基因的毒力质粒较大，在传代过程中稳定性不佳。李金磊等[32]发现ipaH基因同时多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒上，能够在遗传中保持稳定性，不会因传代而缺失。因此，在制备志贺氏菌DNA质控品时应首选ipaH基因。

3.3 分子水平质控品的应用

在分子生物学检验过程中，质粒 DNA 标准物质，即含有待检测目的基因特异性片段的重组质粒分子，常用来作为阳性对照物和质控物，现已被普遍使用。在食源性致病微生物分子生物学检测及鉴定方面，例如，ISO相关标准中，利用PCR快速检测技术以及食品微生物免疫学检测方法来实现致病微生物的确认，其原理是通过利用目标微生物的反应结果来对检验方法的适用性进行评估。同时，在分子生物学检验活动中，把含有目标生物的DNA 片段作为阳性质控样品，来进行监控整个实验流程中的各个操作环节。如核酸提取、PCR体系配置、基因扩增等环节，可通过该方法监控以及验证其是否存在误差与污染，实验方案是否具有可行性等作用，进而实现食品检测过程中的高准确性。

4 总结

与其他类型的食品检验相比，微生物体积微小、繁殖速度快，使得食品微生物检验更具难度，而食品质控品在微生物检测工作中保障检验结果精确性的同时，可以提升我国食品卫生检测水平。但当前对于质控样品的研发仅仅停留在一些生活中常见的食源性致病微生物，而且各个实验室对于同种微生物质控品重复开发，导致食品微生物质控样品的研制仍存在大量空白。

当前的分子水平质控品仍不能满足市场的实际需求，应加强对一些有潜在暴发性的食源性致病微生物质控品的研制，应对突如其来的食源性致病微生物导致的疾病，对其进行检测。核酸质控样品具有多种优点，如在制备方面，以微生物为载体进行传代培养并无限获得，方便提取，节省资源；在储存方面，其可在冷冻条件下长期储藏，提高了微生物检测结果的准确性，在经济价值方面，同一个质粒可设计并插入多个外源基因，节省成本。

需要注意的是，对于标准菌株、质控样品等的使用以及制备过程应当提前了解好微生物的特性，保证其处于最佳生长状态。在使用过程中应详细阅读操作说明，用后应按照规范进行彻底销毁，避免造成环境污染。