卤汤中5种香辛料主效成分的提取检测和溶出规律研究

蒋莹，邢政，吴婷，徐晓云*

(1.华中农业大学 食品科学技术学院，武汉 430070；2.华中农业大学果蔬加工与品质调控湖北省重点实验室，武汉 430070)

酱卤加工是中国传统食品的加工方式之一，是将香辛料、原料及其他辅料加入水中经过煮制而获得的具有典型风味特征的酱卤制品。丁香、八角、桂皮、辣椒、胡椒等是酱卤常用的香辛料[1]，其卤煮时主效成分的溶出在很大程度上影响甚至决定产品风味。桂皮香气浓郁，先有甜感，后觉辛辣[2]，由樟科植物肉桂的树皮经干燥而成，桂皮含有丰富的挥发油，其中肉桂醛为肉桂挥发油的主要成分[3]。丁香属桃金娘科植物，其花蕾干燥后被用作香辛料，丁香酚是其挥发油的主要非特有成分，占比75%～88%，有强烈的丁香味和辛香味[4]。胡椒被赞誉为“香料之王”，是世界上用途最广泛的香辛料之一，胡椒果实中的主效成分是胡椒碱，能够给食材提供热辣的口感，促进食欲[5]。辣椒属茄科草本植物，干辣椒作为天然香辛调味料是酱卤食品中不可或缺的香料，而辣椒碱和二氢辣椒碱则是承载辣椒辛辣味的主要来源，占总辣椒碱的90%左右[6]。研究表明，以上几种香辛料的主效成分脂溶性好，在煮制过程中大部分溶解在油相中。

卤汤中香辛料的主效成分是酱卤产品风味的决定性因素之一，因此高效、准确检测卤汤中香辛料的主效成分对于产品风味的控制具有重要意义，但是目前的研究只针对卤汤中单一主效成分或各主效成分的分开提取检测研究，如杨莉等[7]通过甲醇提取火锅底料汤底中的辣椒素类物质(Cap-S)并用HPLC检测含量；程琦等[8]采用HPLC分别检测卤汤中丁香酚、羟基-β-山椒素和橙皮苷。但关于卤汤中肉桂醛、丁香酚、胡椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱这几种主效成分的同时提取和检测国内外尚未见报道，有必要建立多种香辛料主效成分同时定量检测的方法。此外，为提高香辛料主效成分在卤制加工中的溶出率，使原材料得以充分利用，探索主效成分的溶出规律有着重要意义。有研究表明，卤煮时间[9]、油脂类型[10]等因素对某些香辛料主效成分的溶出有显著影响。因此，本研究以卤煮中卤煮时间、食盐浓度、油脂种类和添加量为主要工艺参数，探究不同卤煮条件下香辛料主效成分的溶出规律，为香辛料的科学使用提供了参考。

本研究在简化卤煮体系下，探索了不同卤煮条件下4种香辛料的溶出规律，比较了3种提取方式提取净化的目标物，优化了卤汤中主效成分的提取，建立了5种香辛料主效成分同时进行UPLC定量检测的方法，为传统酱卤加工制品加工过程中风味的标准化控制提供了参考。

图1 辣椒碱、二氢辣椒碱、胡椒碱、肉桂醛及丁香酚分子结构式

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣椒碱标准品(纯度≥98%)：CAS号2444-46-4；二氢辣椒碱标准品(纯度≥98%)：CAS号19408-84-5；丁香酚标准品(纯度≥98%)：CAS号97-53-0；胡椒碱标准品(纯度≥98%)：CAS号94-62-2；肉桂醛标准品(纯度≥98%)：CAS号104-55-2，均购于上海源叶生物科技有限公司；甲醇(色谱级)、乙腈(色谱级)：美国TEDIA公司；甲酸(色谱级)、二甲基亚砜(色谱级)：天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷：国药集团化学试剂有限公司；桂皮、丁香、辣椒、胡椒及油脂样品：均为市售。

1.2 仪器与设备

Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱仪；Cenlee 20R台式高速冷冻离心机；DF-101S加热磁力搅拌器；R-1001VN旋转蒸发仪；DC150-2氮吹仪；KQ-600DE超声波清洗器；Milli-Q超纯水仪；Heratherm电热恒温鼓风干燥箱。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

干香辛料样品的预处理：将辣椒、胡椒、丁香、桂皮放入60 ℃干燥箱中烘制12 h至恒重(辣椒样品需除杂除蒂)，分别粉碎，过100目筛，称量，装袋于-20 ℃备用。

卤汤的制备：本实验以通常酱卤企业卤汤中14%平均油脂含量构建简化卤汤来研究辣椒、胡椒、丁香、桂皮等在卤煮过程中主效成分的溶出规律。分别称量上述预处理的香辛料样品：辣椒2.60 g，丁香、胡椒、桂皮各0.08 g，置于500 mL的圆底烧瓶中，加入186.00 g纯净水、14.00 g大豆油，于130 ℃的油浴中加热20 min得到卤汤。

1.3.2 UPLC检测香辛料主效成分

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC HSS T3反向色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，洗脱梯度：0～10 min，30%～60% A；10～12 min，60%～62%A；12～14 min，62%～70% A；14～15 min，70%～30% A；15～16 min，30% A；柱温：25 ℃；流速：0.2 mL/min；进样量：2 μL；检测波长：280 nm(肉桂醛、丁香酚、辣椒碱和二氢辣椒碱)和343 nm(胡椒碱)。

1.3.2.2 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

混合标准溶液：精密称量肉桂醛、丁香酚、胡椒碱、辣椒碱、二氢辣椒碱标准品适量，配成100 mmol/L的储备液，于-80 ℃保存。取上述标准液，以甲醇为溶剂，配制肉桂醛、丁香酚、胡椒碱、辣椒碱、二氢辣椒碱的混合梯度稀释溶液，现配现用。以5种标准品的浓度(μg/mL)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2.3 检出限、定量限、回收率

按S/N约为3和S/N约为10分别确定该方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)，单位为μg/mL，将定量限溶液重复进样6次，计算峰面积的RSD，确认方法在定量限浓度下的精密度；在大豆油空白样品中添加浓度分别为0.15,0.30,0.60 μg/mL的混合标准溶液，按照1.3.2和1.3.3已确定的方法提取、检测，计算回收率和RSD。

1.3.3 提取方法

将1.3.1制备好的卤汤倒入分液漏斗中，静置后获得上层油相。

甲醇[11]：称取上层油样2.0 g于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋混匀1 min，超声频率70 kHz，提取15 min，8000 r/min冷冻离心5 min，收集溶剂于试管中，再重复加入4 mL甲醇提取2次，合并3次提取液。

乙腈饱和的正己烷[12]：称取上层油样2.0 g于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈饱和的正己烷溶液，涡旋混匀1 min，经过10 min静置后，再向离心管中加入10 mL乙腈饱和的正己烷溶液，超声频率70 kHz，提取2 min，8000 r/min离心5 min，取出乙腈层溶液，另外重复加入4 mL乙腈饱和的正己烷提取2次，合并3次提取液。

石油醚[13]：称取上述卤煮液中的上层油样2.0 g于50 mL离心管中，加入10 mL石油醚溶解油液，而后加入10 mL甲醇，超声频率70 kHz，提取2 min，8000 r/min离心5 min，收集甲醇相，再重复加入4 mL甲醇提取2次，合并3次提取液。

分别取上述3种提取处理的样品，加入甲醇(乙腈、甲醇)定容至20 mL，用移液枪移取5 mL样液于45 ℃水浴中并用氮气吹至近干，甲醇(乙腈、甲醇)定容至1 mL，将提取液过0.22 μm的有机滤膜，留作UPLC测定。

1.3.4 不同卤煮条件对主效成分溶出的影响

1.3.4.1 卤煮时间对香辛料主效成分溶出的影响

称量烘干磨成粉的辣椒2.60 g，丁香、胡椒、桂皮各0.08 g，置于500 mL的圆底烧瓶中，加入186.00 g纯净水、14.00 g大豆油，放入130 ℃的油浴中分别加热20，50，80，110，140 min得到卤汤。

1.3.4.2 油脂类型对香辛料主效成分溶出的影响

称量烘干磨成粉的辣椒2.60 g，丁香、胡椒、桂皮各0.08 g，置于500 mL的圆底烧瓶中，加入186.00 g纯净水、14.00 g油脂，放入130 ℃的油浴中加热20 min，油脂类型分别为玉米油、葵花籽油、花生油、牛油、猪油和羊油。

1.3.4.3 油脂含量对香辛料主效成分溶出的影响

称量烘干磨成粉的辣椒2.60 g，丁香、胡椒、桂皮各0.08 g，置于500 mL的圆底烧瓶中，加入质量比分别为3.5%、7.0%、14.0%、28.0%、56.0%的葵花籽油，剩余质量用纯净水补齐，放入130 ℃的油浴中加热20 min得到不同油脂含量的卤汤。

1.3.4.4 食盐浓度对香辛料主效成分溶出的影响

称量烘干磨成粉的辣椒2.60 g，丁香、胡椒、桂皮各0.08 g，置于500 mL的圆底烧瓶中，加入372.00 g纯净水、28.00 g葵花籽油、质量比分别为1%、2.5%、5%、10%、20%的食用盐，充分溶解后，放入130 ℃的油浴中加热20 min得到卤汤。

1.3.5 数据处理

采用仪器自带的Empower软件对UPLC所得的数据进行峰面积积分处理，利用SPSS 20进行统计分析，GraphPad Prism 8 进行绘图处理，设置显著性水平为P<0.05，结果表示为平均值±标准差，每组实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

查阅文献得知肉桂醛[14]、丁香酚[15]、胡椒碱[16]、辣椒碱和二氢辣椒碱的最大吸收波长分别为289，283，340，280，280 nm。对这5种目标物质进行全波长扫描，当波长为280 nm时，肉桂醛、丁香酚、辣椒碱、二氢辣椒碱有较大的吸收，而胡椒碱在340 nm下有较高的吸光度，因此选择280 nm和340 nm对目标物质进行双波长同时检测，见图2。甲醇-水和乙腈-水是反向高效液相分析中最常用的流动相组合，在等度洗脱模式下，尝试了不同种类及不同比例的有机溶剂与水和甲酸水作为流动相都没有将目标物质明确分开，可能是因为目标物质性质差别较大，单一的流动相极性不能将这5种物质有效分离。用乙腈代替甲醇，物质峰峰宽较窄，峰形较好，加酸可以改善分离度，减少峰拖尾，因此最终采用乙腈(A)-0.1%甲酸水，梯度洗脱程序为：0～10 min，30%～60% A；10～12 min，60%～62% A；12～14 min，62%～70% A；14～15 min，70%～30% A；15～16 min，30% A，见图3。5种组分均在16 min内被检出，出峰完好，峰形尖锐。

图2 肉桂醛、丁香酚、胡椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱全波长扫描图

图3 肉桂醛、丁香酚、胡椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱5种混标色谱图

2.2 方法的线性范围、检出限和定量限

按照1.3.2对不同质量浓度的卤煮液上层油相中5种目标物质的标准溶液进行测定，肉桂醛、丁香酚、胡椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱的标准曲线回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限见表1。5种目标物质在相应线性范围内线性关系良好，相关系数均≥0.9998。

表1 5种目标物质的线性范围、线性方程和相关系数

2.3 提取方法的选择

甲醇和乙腈是液液萃取中常用的有机溶剂，其溶解范围广，但通常不与油脂混溶，许多溶解在植物油中的脂溶性物质都可以用甲醇和乙腈有效提取。实验结果表明，甲醇和乙腈饱和的正己烷提取5种目标物质，UPLC检测时基质干扰较低，且目标物质能较好地分离，但乙腈饱和的正己烷提取出的各个主效成分含量都更高(P<0.05)。另有文献表明富含油脂的基质需要通过溶油试剂处理，再用有机试剂萃取得到目标物质，因此，选用与油脂混溶的石油醚、甲醇提取，此提取溶剂与乙腈饱和的正己烷萃取目标物质的含量不显著(P>0.05)，但样品溶液较为浑浊，长期使用会污染色谱柱，使色谱柱寿命降低。结果显示各溶剂检出的各个目标物质含量为乙腈饱和的正己烷>石油醚>甲醇。

表2 不同提取方法检测的主效成分含量

2.4 回收率实验

选择乙腈饱和的正己烷为最终的样品前处理手段，进行加标回收实验。分别吸取1.3.2配制的标准溶液，添加浓度分别为0.15，0.30，0.60 μg/mL的混合标准溶液于0.5 g大豆油中，超声提取，每个浓度平行测定3次。由表3可知，肉桂醛的平均回收率为88.1%～102.9%，丁香酚的平均回收率为92.8%～101.5%，胡椒碱的平均回收率为99.6%～107.6%，辣椒碱的平均回收率为84.6%～91.4%，二氢辣椒碱的平均回收率为100.2%～101.9%，相对标准偏差(RSD)为0.2%～2.2%，表明该方法有较好的稳定性，能实现准确定量。

表3 加标回收率实验结果

2.5 不同卤煮条件对主效成分溶出的影响

2.5.1 卤煮时间对香辛料主效成分溶出的影响

由图4可知，随着卤煮时间的延长，在20～80 min之间辣椒碱、二氢辣椒碱的溶出量先升高，80 min后逐渐下降，二者溶出趋势一致；胡椒碱溶出呈现波动趋势，在110 min溶出量达到最大值，随后持续加热分解，溶出量显著下降；而丁香酚和肉桂醛在第20 min时溶出量已经达到了最大值，随着时间的延长，溶出量逐渐降低，且之前已溶出的主效成分经过长时间的加热后部分分解，在80～140 min之间变化趋于平缓，但丁香酚在煮制20～80 min时下降较快，说明丁香酚易溶出，且加热稳定性较差。在110～140 min，5种目标物质的溶出量均有所下降，溶出量不会随卤煮时间的继续延长而增加。

图4 卤煮时间对5种主效成分溶出规律的影响

卤煮时间影响主效成分的溶出和降解，各主效成分在卤煮过程中水相和油相不断迁移，达到溶出平衡后，随着加热时间延长而逐渐分解，辣椒碱和二氢辣椒碱的溶出和降解趋势相似，这与Cheok等[17]的研究结论一致。肉桂醛、丁香酚、胡椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱达到溶出平衡的时间点不同，可能与物质本身的极性和卤煮液的性质有关，实际生产中掌握卤煮时间对各主效成分溶出规律的影响可节省时间和原料。

2.5.2 油脂类型对香辛料主效成分溶出的影响

5种香辛料主效成分都是脂溶性物质，不同油脂类型可能会影响其在卤煮过程中的溶出情况。动植物油的脂肪酸比例差异显著，各油脂的脂肪酸含量见表4，植物油含有丰富的多不饱和脂肪酸，而动物油中饱和脂肪酸含量居多。使用葵花籽油进行卤煮，各主效成分溶出含量最多，见图5。与其他油脂相比，葵花籽油卤煮体系中胡椒碱溶出显著(P<0.05)，丁香酚、辣椒碱和二氢辣椒碱在葵花籽油和玉米油中与其他油脂相比溶出差异显著(P<0.05)，而肉桂醛在牛油和猪油及其他几种油脂中的溶出均不显著(P>0.05)。

表4 油脂的脂肪酸含量组成

图5 油脂类型对5种主效成分溶出规律的影响

不同油脂的脂肪酸组成不同，且油脂在卤煮过程中会产生质量的变化，包括脂肪酸含量的改变，有文献表明，在加热过程中已溶出的辣椒碱不仅会受到热损失，同时脂肪酸氧化生成的自由基也会使辣椒碱降解[18]，由此可以猜测不同油脂在卤煮过程中的变化会影响5种香辛料主效成分的含量。葵花籽油、花生油等不饱和脂肪酸含量高，而牛油等动物性油脂的不饱和脂肪酸含量则较低，有研究认为由于食用油脂在加热过程中发生热氧化、热聚合等反应，脂肪酸生成极性大的物质，且相同加热条件下植物油如葵花籽油比牛油生成的极性物质更多[19]，因此各主效成分在葵花籽油中溶出更高，与其他油脂相比更有利于肉桂醛、丁香酚、胡椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱的溶出。

2.5.3 油脂含量对香辛料主效成分溶出的影响

肉桂醛、丁香酚、胡椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱都属于脂溶性物质，能很好地溶于油脂中。不同油脂含量对5种主效成分溶出量的影响见图6。随着卤汤中油脂比例逐渐升高，各主效成分的溶出量均有所上升，丁香酚、胡椒碱和辣椒碱在油脂含量为28%时已完全溶于油脂中，增加油脂含量反而相当于稀释了其浓度，而肉桂醛和二氢辣椒碱随着油脂含量升高，其溶出量也逐渐上升，表明油脂含量越高越有利于肉桂醛和二氢辣椒碱的溶出，油脂含量为56%时，其溶出量达到最大值，但考虑到实际酱卤生产过程中，油脂含量不可能超过56%，因此未对更高的油脂比例进行考察。

图6 油脂含量对5种主效成分溶出规律的影响

2.5.4 食盐浓度对香辛料主效成分溶出的影响

食盐是烹饪中必不可少的调味料之一，食盐添加量会影响卤煮液中离子强度，进而影响卤煮过程中香辛料主效成分的溶出。不同食盐添加量下5种主效成分的溶出情况见图7，食盐浓度为1%～5%时，肉桂醛和丁香酚的溶出量呈降低趋势，而10%时两者的溶出量达到最高值，当食盐浓度升到20%时溶出量急剧下降。胡椒碱的含量在食盐浓度为1%时最高，随着食盐浓度的增加，其溶出量先显著下降后缓慢上升，随后在20%的急剧下降。辣椒碱和二氢辣椒碱随着食盐浓度的升高溶出规律相似，盐浓度为1%～5%时，两者溶出量逐渐上升到最高，达到5%后，和另外3种主效成分一致，辣椒碱和二氢辣椒碱的含量出现骤然下降的趋势。说明适当的食盐浓度对于各主效成分的溶出有一定的促进作用，而过高的食盐浓度则不利于主效成分的溶出，可能是食盐的离子强度影响卤煮液的极性，从而影响主效成分的溶出量[20]。

图7 食盐浓度对5种主效成分溶出规律的影响

3 结论

乙腈饱和的正己烷提取法属于液液分配净化法，香辛料主效成分和油脂被正己烷提取后，由于这5种主效成分的极性比油脂大，加入极性溶剂乙腈后，通过振摇或者超声能使目标物质进入乙腈相中，重复提取几次能使目标物质几乎完全与油脂分离。本文通过UPLC分析比较了甲醇、乙腈饱和的正己烷和石油醚对5种主效成分的提取效果，乙腈饱和的正己烷提取效果最好，对卤汤上层油相中5种主效成分的回收率可达84.6%～107.6%，说明该方法稳定性好。

另外，研究了桂皮、丁香、胡椒和辣椒的主效成分肉桂醛、丁香酚、胡椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱在模拟卤煮体系中的溶出规律。卤煮时间影响香辛料主效成分的溶出平衡，油脂含量和类型影响卤煮液的极性，而食盐浓度对卤汤中的离子强度产生影响。通过实验最终得到了4种卤煮常用香辛料中的5种主效成分在不同卤煮条件下的溶出规律，丁香酚和肉桂醛、辣椒碱和二氢辣椒碱、胡椒碱分别在第20，80，110 min时溶出量最大，葵花籽油对各主效成分的溶出最显著，油脂含量为28%时丁香酚、胡椒碱和辣椒碱几乎全部溶出，而二氢辣椒碱和肉桂醛在油脂含量为56%时还在继续溶出，胡椒碱、辣椒碱和二氢辣椒碱、丁香酚和肉桂醛在食盐浓度分别为1%、5%、10%时溶出量最高。卤煮条件与这5种主效成分的溶出密切相关，因此应多关注实际生产中的卤煮过程，后期可对卤煮条件影响溶出的机制进行深入研究。