MCM4基因在子宫内膜癌中表达和临床意义的生物信息学分析①

魏 敏 王丽娜 白雪飞 滕 菲 王 静

（兰州大学第一医院妇产科，甘肃省妇科肿瘤重点实验室，兰州 730000）

子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，占妇科恶性肿瘤的20%～30%，女性恶性肿瘤的7%［1］。随着人口出生率的下降和肥胖患者的增加，其发病率和病死率正在逐年上升［2-3］。有数据表明，75%的EC 患者可以在早期诊断，其五年生存率可达65%～92%［4-5］。但对于晚期和复发患者，以及临床侵袭性强的组织学类型（如高级别子宫内膜样癌、浆液性癌）患者，临床预后往往较差［6］。因此，早期筛查和准确诊断是改善患者结局的关键，但目前的生物标志物不足以对其进行早期和准确的诊断。因此，寻找新的敏感的生物标志物以改善诊断具有重要意义。

微小染色体维持蛋白4（mini chromosome maintenance proteins 4，MCM4）属于微小染色体维持蛋白家族，是MCM2-7 六聚体复合体的组成部分，具有ATP 酶活性，是解开DNA 双螺旋解旋酶的核心，并参与复制叉的形成［7］。研究发现，MCM4 异常表达可促进细胞增殖和肿瘤发生，且在多种肿瘤中可作为一个有价值的预后标志物。然而，MCM4在EC 中的作用机制仍不明确。

本研究基于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，比较了MCM4在EC 和正常子宫内膜组织中转录和翻译水平的差异表达，评估了MCM4 mRNA 表达与临床病理参数间的相关性，回顾性分析了MCM4 mRNA表达与EC患者预后的关系，并探讨了MCM4 的共表达基因及可能的生物学功能，为EC的诊断提供潜在靶点。

1 资料与方法

1.1 TCGA 数据库MCM4 mRNA 表达水平和临床数据下载 从TCGA 数据库（https：//cancergenome.nih.gov/）中下载子宫内膜癌（UCEC）患者的mRNA表达数据及临床信息，用R 软件（v3.6.3）和Perl 语言处理并整合数据，共得到552 例EC 组织和35 例正常子宫内膜组织（包含23 对配对的癌和癌旁组织）数据。将552 例EC 标本以MCM4 mRNA 表达量中位值为界，分为高表达组和低表达组。

1.2 HPA 和Ualcan 数据库分析MCM4 蛋白的表达 研究选取人类蛋白表达图谱数据库（Human Protein Atlas，HPA）中的免疫组织化学抗体（HPA004873），分析EC 和正常子宫内膜组织中MCM4蛋白的表达及染色程度。

通过检索临床蛋白质组肿瘤分析协作组数据集（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC），再次验证MCM4 蛋白在100 例EC 组织和31例正常子宫内膜组织中的表达。

1.3 TCGA 数据库EC 中MCM4 的共表达基因及富集分析 利用TCGA 数据库mRNA 表达数据，以|cor| ＞0.3 和P＜0.05 为阈值，用R 软件“stat”包分析子宫内膜中MCM4 的共表达基因，以FDR＜0.2 和P＜0.05 为阈值，“clusterProfiler”包进行富集分析，“ggplot2”包可视化结果。

1.4 统计学处理 研究中所有的统计分析均采用R 语言软件（v3.6.3）完成，ROC 曲线由“pROC”包生成，MCM4基因在EC 组织与正常子宫内膜组织间的表达差异采用Mann-WhitneyU检验，配对样本间的差异采用配对t检验，MCM4 mRNA 表达水平与病理参数间的相关性采用Logistic 检验，生存分析采用Kaplan-Meier 和Cox 分析。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA 数据库中EC 患者MCM4 mRNA 表达情况 研究发现MCM4 mRNA 在EC 组织中的表达明显高于正常子宫内膜组织（P＜0.05，图1A）及配对的癌旁组织（P＜0.05，图1B）；MCM4 mRNA 的表达量在Ⅲ/Ⅳ期患者较Ⅰ/Ⅱ期患者明显增高（P＜0.05，图1C），高级别（G2/G3）患者较低级别（G1）患者明显增高（P＜0.05，图1D），浆液性EC患者较子宫内膜样腺癌患者明显增高（P＜0.05，图1E）。当MCM4 mRNA 表达的界值为2.902 时，ROC 曲线下面积为0.966（图1F）。

图1 MCM4 mRNA在EC组织中的差异表达和ROC曲线Fig.1 Differential expression of MCM4 gene in EC tissues and ROC curve

2.2 TCGA 数据库中MCM4 mRNA 表达与EC 患者临床特征的关系 研究发现，MCM4 mRNA 高表达水平与FIGO 分期（ⅢvsⅠ，P=0.014）、组织学类型（serousvsendometrioid，P＜0.001）和 组 织 学 分 级（G2vsG1，G3vsG1，P＜0.001）密切相关（表1）。

表1 MCM4 mRNA表达与EC临床病理特征的相关性Tab.1 Association between MCM4 mRNA expression and clinicopathological characteristics of EC

2.3 TCGA 数据库中MCM4 mRNA 表达水平与EC患者不良预后相关 Kaplan-Meier 分析显示，MCM4 mRNA 高表达组EC 患者总生存期明显缩短（P=0.001，图2A），在子宫内膜样腺癌中MCM4 mRNA高表达组患者总生存期也明显缩短（P=0.001，图2B）。单因素Cox 分析表明MCM4 mRNA 的表达水平、FIGO 分期、组织学分级、病理类型、肌层浸润深度和年龄与患者的不良预后相关（表2），多因素Cox 分析表明FIGO 分期、组织学分级和MCM4 表达量是影响EC患者总生存率的独立危险因素（表2）。

表2 EC预后影响因素的单因素、多因素Cox回归分析Tab.2 Univariate and multivariate Cox regression of EC overall survival

图2 MCM4 mRNA表达与EC患者生存率的关系Fig.2 Correlation between expression of MCM4 mRNA and survival rate of EC patients

2.4 MCM4蛋白在EC 组织中高表达 HPA 数据库分析结果显示，MCM4 蛋白主要表达于EC 细胞核，EC 组织中MCM4 蛋白表达明显高于正常子宫内膜组织（图3A、B）；CPTAC 数据库证实了同样的结果，MCM4 蛋白在EC 组织中的表达明显高于正常子宫内膜组织（P＜0.001，图3C）。

图3 MCM4蛋白在子宫内膜癌组织中的差异表达Fig.3 Differential expression of MCM4 protein in EC tissues

2.5 EC 中MCM4共表达基因功能富集分析 为了探究EC中MCM4潜在的分子机制，本研究进行了共表达基因功能富集分析。结果显示与MCM4正相关的基因有3 383个，负相关的基因有705个。热图分别展示前20 个与MCM4 正相关（图4A）和负相关（图4B）的共表达基因，功能富集分析结果显示，共表达基因主要富集于细胞周期、DNA 复制和范科尼贫血通路，其主要的分子功能是保持解旋酶活性和DNA依赖的ATP酶活性（图4C）。

图4 EC中与MCM4的共表达基因及生物学功能分析Fig.4 Co-expression gene and biological function analysis of MCM4 in EC

3 讨论

EC是一种由异常腺体增生引起的，伴有基因和蛋白异常表达的常见恶性肿瘤［8］，因缺乏精确的诊断和治疗的分子靶标，全世界EC 患者的病死率正逐年上升。

微小染色体维持蛋白家族（mini-chromosome maintenance proteins，MCMs）是由9 个相关蛋白质（MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、MCM8、MCM9、MCM10）组成的一类细胞内蛋白，在DNA复制和细胞周期调控中发挥重要作用［9］。在这些蛋白质中，MCM2-7形成一种DNA解旋酶复合体，在启动DNA 复制起点、激活DNA 复制和促进DNA合 成中发挥重要作用［9］。MCM4 主要参与S 期前DNA 复制的起始，不正确的复制叉进程可导致复制叉停滞，潜在的不完整的DNA 复制和破裂的复制叉结构可能导致DNA 双链断裂［10-11］。因此，MCM4 蛋白在维持基因组完整性方面发挥重要作用，MCM4蛋白表达异常有助于细胞增殖和肿瘤发生。

最近的研究发现，MCM4在乳腺癌、食管鳞状细胞癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌等多种肿瘤中高表达［12-17］。本研究证实了MCM4 mRNA 在EC 中的表达明显高于正常子宫内膜及配对的癌旁组织。在蛋白水平上同样证实MCM4 在EC 中的表达明显高于正常组织。ROC 分析显示，MCM4 具有较高的诊断价值，这些结果表明MCM4是诊断EC的潜在分子靶标。

多项研究报道，MCM4 异常表达与多种肿瘤患者的不良预后相关，是一个预测患者预后的可靠指标，甚至可能成为治疗靶点。XU 等［18］研究发现MCM4 高表达肝癌患者的临床分期更晚，生存时间更短，沉默MCM4 可显著抑制肝癌细胞的增殖和肝癌移植瘤的生长。HAN 等［19］证实MCM4 在喉鳞状细胞癌中高表达，与患者的不良预后相关，是一个有价值的预后指标，这与本研究结果一致。本研究结果同样发现MCM4 mRNA 的表达与EC 患者的不良预后明显相关，多因素Cox 回归分析提示，MCM4高表达是EC 患者的独立危险因素，进一步表明，MCM4 是EC 的致病基因。子宫内膜样腺癌是子宫内膜最常见的病理类型，本研究同样发现在子宫内膜样腺癌中MCM4 mRNA的表达与患者的不良预后显著相关。几乎所有的EC 风险分层系统都综合了临床分期、组织学类型和分级［20］，本研究中单因素Cox 回归分析和Logistic 分析结果显示，MCM4 mRNA 的表达与EC 患者的FIGO 分期、组织学类型和组织学分级密切相关，表明MCM4可能是EC的潜在治疗靶点。通过对其共表达基因富集分析发现，其可能的机制是通过细胞周期、DNA 复制和范科尼贫血通路而导致EC 的发生。SAINI 等［21］研究发现，在EC 细胞株中沉默CYP1B1 后，可显著下调MCM4表达，这为课题组进一步在EC 细胞系中研究MCM4的致病分子机制提供了可靠依据。

综上所述，本研究证实了MCM4在EC中的诊断和预后价值，但研究仍然存在不足之处，课题组只进行了生物信息学分析，未在临床样本中验证，同时，应在EC 细胞系中进行其生物学功能及机制的研究，这将是课题组后续研究的方向。