山慈菇提取物调控circ_0003998/miR-330-5p表达对口腔鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响

庞真贞，蔡志宇，王小苗，邹 怡，王 良

(1.保定市第一中心医院a.口腔一科； b.导管室，河北 保定 071000； 2.定州市人民医院口腔科，河北 定州 073000； 3.唐山市丰润区人民医院口腔科，河北 唐山064000； 4.河北省易县医院口腔科，河北 易县 074200)

口腔鳞状细胞癌(鳞癌)是最常见的口腔癌类型，虽然多种现代手术技术和策略用于治疗口腔鳞癌，但由于局部复发和远处转移，口腔鳞癌的病死率、5年生存率仍未改变[1]。近年来，多种中药化合物已用于癌症治疗并显示良好疗效。山慈菇是我国传统中药，性寒味甘，具有清热解毒、化痰散结功效。目前研究[2-3]证实山慈菇提取物通过诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖、迁移和侵袭在乳腺癌中表现出显著抗肿瘤作用。山慈菇提取物可能通过调控微小RNA(miR)-329-3p表达抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[4]。但山慈菇提取物对口腔鳞癌生物学行为的影响尚未见报道。环状RNA 0003998(circ_0003998)是近年发现的癌基因，circ_0003998高表达与肝癌患者的总生存率较差相关[5]。非小细胞肺癌中circ_0003998上调与肿瘤大小和淋巴结转移有关，下调circ_0003998对癌细胞的增殖和侵袭有抑制作用[6]。生物信息学显示miR-330-5p是circ_0003998潜在靶点。miR-330-5p已被证实在皮肤恶性黑色素瘤、胶质母细胞瘤中具有抗增殖、抗侵袭作用[7-8]，但circ_0003998是否靶向miR-330-5p参与口腔鳞癌进展尚不清楚。本研究以口腔鳞癌细胞CAL-27为研究对象，通过体外实验分析山慈菇提取物对CAL-27细胞增殖、迁移、侵袭以及circ_0003998、miR-330-5p表达的影响，验证circ_0003998靶向miR-330-5p在口腔鳞癌进展中的作用，旨在探讨山慈菇提取物抗口腔鳞癌的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织来源

21例口腔鳞癌组织和对应正常口腔黏膜组织均取自2018年3月至2019年3月间在保定市第一中心医院接受手术的口腔鳞癌患者，其中男16例，女5例；年龄35～73岁，平均(57.1±7.20)岁。肿瘤组织经病理诊断证实为口腔鳞癌组织，所有患者术前未接受任何抗肿瘤治疗。

1.1.2 细胞和试剂

人口腔鳞癌细胞CAL-27、人口腔黏膜上皮细胞(武汉普诺赛生物科技有限公司)；山慈姑(亳州市弘宝堂商贸有限公司)；Transwell小室(北京优尼康生物科技有限公司)；羊抗兔IgG二抗、兔源E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(上海艾博抗(上海)贸易有限公司)；cDNA合成试剂盒、SYBR Green PCR master mix(北京百奥莱博科技有限公司)；一步法miRNA反转录试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)；荧光素酶报告载体、circ_0003998小干扰RNA(si-circ_0003998)及其阴性对照(si-NC)、miR-330-5p模拟物(mimics)及其阴性对照、miR-330-5p抑制物(anti-miR-330-5p)、circ_0003998过表达质粒(pcDNA-circ_0003998)(广州锐博生物技术有限公司)。

1.2 检测方法

1.2.1 山慈姑提取物的制备

参照兴伟等[3]实验方法进行，将山慈菇粉碎，加入去离子水浸泡2 h，水煎法制备山慈菇提取液，然后用旋转蒸发仪进行浓缩，制备山慈菇提取液浓度为1 g·mL-1，高压灭菌后保存备用。

1.2.2 山慈姑提取物浓度筛选

将对数期CAL-27细胞、人口腔黏膜上皮细胞以5×103个·孔-1的密度接种96孔板，贴壁后，分别用含0、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg·mL-1山慈姑提取物DMEM培养基孵育细胞48 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液继续孵育2 h，酶标仪检测450 nm处各孔光密度(OD)值。

1.2.3 实时定量PCR(RT-qPCR)检测circ_0003998和miR-330-5p表达

trizol试剂抽提正常口腔黏膜组织、口腔鳞癌组织的总RNA。分别用cDNA合成试剂盒、miRNA逆转录试剂盒合成circ_0003998、miR-330-5p的cDNA。利用SYBR Green PCR master mix配置反应体系进行RT-qPCR。circ_circ_0003998上游5′-AAAGAGGCTCATCACTGTCAGG-3′，下游5′-GGACTGGGGTTTTGACTG GAT-3′；miR-330-5p上游5′-TCCTCTGGGCCTGTGTCTTAG-3′，下游5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；GAPDH上游5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′，下游5′-CCAGGCGCCCAATACG-3′。2-ΔΔCt方法计算circ_0003998、miR-330-5p相对表达量。

1.2.4 集落形成实验检测细胞增殖

分别用含0、2、6.6、20 mg·mL-1山慈姑提取物[3]的DMEM培养液置于5%CO2体积分数、37 ℃恒温培养箱孵育细胞CAL-27，依次记为对照组、山慈菇低剂量组、山慈菇中剂量组、山慈菇高剂量组。孵育48 h后，每组取5×102个CAL-27细胞接种到6孔板，常规培养2周。然后用甲醇固定菌落，0.5%结晶紫染色。显微镜下统计>50个细胞的有效集落以表示细胞增殖能力。

1.2.5 划痕愈合实验检测细胞迁移

将山慈姑提取物处理48 h的CAL-27细胞接种于6孔板上，当细胞生长至融合80%时，用移液枪头尖端在细胞表面单层细胞上划一条直线。显微镜下测量初始划痕距离和培养24 h后划痕距离。以初始划痕宽度和培养24 h划痕宽度的差值表示迁移距离。

1.2.6 Transwell小室法检测细胞侵袭

山慈姑提取物处理48 h后，将1×105个CAL-27细胞悬浮于无血清DMEM中接种于Transwell(包被基质胶)上室，将含10%胎牛血清的培养基接种于下室。孵育24 h后，除去上室膜残留细胞，甲醇固定下室膜贴壁细胞，0.5%结晶紫染色。以显微镜下随机3个视野细胞数均值表示细胞侵袭能力。

1.2.7 蛋白质印记检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达

用放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液裂解山慈姑提取物处理48 h后CAL-27细胞，取等量蛋白质进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜置于塑料盒，加入5%脱脂牛奶封闭1 h，再用一抗4 ℃孵育过夜。最后用二抗孵育膜1 h。化学发光显色，避光条件显影、定影。以GAPDH为内参，Image J软件进行灰度分析。

1.2.8 RT-qPCR检测山慈姑提取物对circ_0003998和miR-330-5p表达的影响

山慈姑提取液处理CAL-27细胞48 h后，trizol试剂抽提细胞总RNA。按1.2.2步骤进行RT-qPCR以检测circ_0003998和miR-330-5p表达水平。

1.2.9 双荧光素酶报告基因实验验证circ_0003998和miR-330-5p靶向关系

circRNA RNA interactome预测到miR-330-5p是circ_0003998的潜在靶基因。基于circ_0003998和miR-330-5p结合位点序列构建circ_0003998野生序列，并将其克隆到荧光素酶基本载体构建野生型(WT-)荧光素酶报告载体WT-circ_0003998。同时突变与miR-330-5p结合位点的circ_0003998序列，构建突变荧光素酶报告载体MUT-circ_0003998。按照脂质体转染法将WT-circ_0003998或者MUT-circ_0003998分别与miR-330-5p mimics或miR-NC共转染CAL-27细胞，48 h后用荧光素酶活性测定试剂盒分析细胞中荧光素酶活性。

1.2.10 细胞转染

将2×105个对数期CAL-27细胞在6孔板中培养过夜，然后使用Lipofectamine 2000试剂盒瞬时转染si-circ_0003998、si-NC、miR-330-5p mimics、miR-NC、pcDNA-circ_0003998、anti-miR-330-5p至CAL-27细胞，收集转染48 h后细胞。转染si-circ_0003998、si-NC、miR-330-5p mimics、miR-NC的细胞标记为si-circ_0003998组、si-NC组、miR-330-5p组、miR-NC组。用含20 mg·mL-1山慈姑提取物的培养液孵育未转染或转染pcDNA-circ_0003998或转染anti-miR-330-5p细胞48 h，依次记为山慈菇组、山慈菇+pcDNA-circ_0003998组、山慈菇+anti-miR-330-5p组。

1.2.11 circ_0003998和miR-330-5p表达对CAL-27细胞增殖、迁移、侵袭的影响分析

收集si-circ_0003998组、si-NC组、miR-330-5p组、miR-NC组、山慈菇组、山慈菇+pcDNA-circ_0003998组、山慈菇+anti-miR-330-5p组CAL-27细胞，按照1.2.3、1.2.4、1.2.5、1.2.6、1.2.7方法分析circ_0003998和miR-330-5p表达对CAL-27细胞生物学行为的影响。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 山慈菇提取物对口腔黏膜上皮细胞及口腔鳞癌细胞的影响及circ_0003998和miR-330-5p在口腔鳞癌组织中的表达

CCK-8检测山慈菇提取物对CAL-27细胞和口腔黏膜上皮细胞活力的影响结果见图1A：0～25 mg·mL-1山慈菇提取物对口腔黏膜上皮细胞活力无显著影响，当其浓度>25 mg·mL-1时口腔黏膜上皮细胞活力呈下将趋势；而0～25 mg·mL-1山慈菇提取物对CAL-27细胞活力的抑制作用具有浓度依赖性，当其浓度>25 mg·mL-1时CAL-27细胞活力趋于平稳。与正常口腔黏膜组织比较，口腔鳞癌组织中circ_0003998表达量升高(P<0.05)，miR-330-5p表达量降低(P<0.05)，见图1B—C。

A：CCK-8检测细胞活力；B：circ_0003998在口腔鳞癌组织中的表达；C：miR-330-5p在口腔鳞癌组织中的表达。*P<0.05。

2.2 山慈菇提取物对CAL-27细胞增殖、迁移、侵袭的影响

低、中、高剂量的山慈菇提取物处理CAL-27细胞48 h后，E-cadherin蛋白表达量升高(P<0.05)，细胞集落形成数、迁移距离、侵袭数量、N-cadherin蛋白表达量降低(P<0.05)。随着山慈菇提取物浓度的增加，其对CAL-27细胞增殖、迁移、侵袭以及E-cadherin和N-cadherin蛋白表达的影响逐渐增强。见表1和图2。

A：E-cadherin、N-cadherin蛋白表达量,*P<0.05与对照组相比,#P<0.05与山慈菇低剂量组相比,△P<0.05与山慈菇中剂量组相比；B：细胞集落形成；C：细胞迁移；D：细胞侵袭。

表1 山慈菇提取物对CAL-27细胞增殖、迁移、侵袭的影响

2.3 山慈菇提取物对CAL-27细胞中circ_0003998、miR-330-5p的影响

低、中、高剂量的山慈菇提取物处理CAL-27细胞48 h后，细胞中circ_0003998表达量降低(P<0.05)，而miR-330-5p表达量升高(P<0.05)。见图3。

*P<0.05与对照组相比，#P<0.05与山慈菇低剂量组相比，△P<0.05与山慈菇中剂量组相比。

2.4 circ_0003998靶向miR-330-5p

circRNA RNA interactome预测到circ_0003998与miR-330-5p序列间存在特异性互补的核苷酸序列，见图4A。相对荧光素酶活性检测结果见图4B，与转染miR-NC比较，转染miR-330-5p mimics的CAL-27细胞中WT-circ_0003998的相对荧光素酶活性降低(P<0.05)，但转染miR-330-5p mimics的CAL-27细胞中MUT-circ_0003998的相对荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)。

*P<0.05与miR-NC组相比。

2.5 过表达circ_0003998或抑制miR-330-5p逆转山慈菇提取物对CAL-27细胞增殖迁移侵袭的作用

与山慈菇组比较，山慈菇+pcDNA-circ_0003998组、山慈菇+anti-miR-330-5p组CAL-27细胞集落形成数、迁移距离、侵袭数量、N-cadherin蛋白表达量升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表达量降低(P<0.05)。见图5和表2。

A:circ_0003998表达量；*P<0.05与山慈菇组相比；B：miR-330-5p表达量；C：E-cadherin、N-cadherin蛋白表达量；D：细胞集落形成。

E：细胞迁移；F：细胞侵袭。

表2 circ_0003998和miR-330-5p对CAL-27细胞增殖、迁移、侵袭的影响

3 讨论

山慈菇为兰科植物杜鹃兰、独蒜兰的假鳞茎，《本草新编》《本草拾遗》等中药典籍对其药理作用均有记载。现代药理研究[9]表明，山慈菇除具有降压、抗菌、治疗痛风等作用外，还具有开发成抗癌药物的潜力。吴俊林等[10]研究发现山慈菇可上调促凋亡基因B细胞淋巴瘤(BCL)-2表达，抑制甲状腺癌细胞增殖。林晓燕等[11]指出，山慈菇水煎剂能够降低胶质瘤细胞U118的增殖、侵袭和迁移能力。此外，山慈菇提取物对乳腺癌大鼠肿瘤组织中血管内皮生长因子表达和肿瘤生长具有抑制作用[12]。本研究结果表明，山慈菇提取物可显著降低CAL-27细胞的增殖、迁移和侵袭能力，且浓度增加，其抑制作用增强，与上述抗肿瘤作用一致。上皮间质转化(EMT)是口腔鳞癌转移的关键过程，表现为上皮细胞获得间质表型、失去细胞极性获得迁移能力[13]。山慈菇提取物可能通过抑制EMT进程发挥抗迁移、侵袭作用。李雪莲等[14]发现山慈菇提取物可影响EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白表达从而抑制乳腺癌EMT，抑制乳腺癌侵袭转移。本研究结果表明山慈菇提取物可抑制口腔鳞癌细胞生物学行为。

circ_0003998是一种已知的致癌circRNA，circ_0003998表达增加与非小细胞肺癌患者较短的总生存期有关，并促进肺腺癌多西他赛耐药，下调circ_0003998可降低肺腺癌细胞多西他赛耐药性，抑制细胞增殖，增强细胞凋亡[6,15]。肝癌中circ_0003998高表达与肝癌患者的侵袭性特征相关，并促进肝癌EMT[16]。miR-330-5p是一种癌症相关基因，有研究[17-18]发现长链非编码RNA(lncRNA)前列腺癌相关转录因子6(PCAT6)、circ_0001727均通过调节miR-330-5p表达来抑制非小细胞肺癌增殖和转移。本研究发现口腔鳞癌组织中circ_0003998表达上调，miR-330-5p表达下调，而山慈菇提取物可诱导miR-330-5p表达，抑制circ_0003998表达，且由于miR-330-5p受到circ_0003998的靶向负性调控，过表达circ_0003998或抑制miR-330-5p表达还可逆转山慈菇提取物对CAL-27增殖、迁移和侵袭，并恢复其恶性生物学行为，这表明在口腔鳞癌中circ_0003998/miR-330-5p分子轴介导山慈菇提取物的抗癌作用。

综上所述，山慈菇提取物通过下调circ_0003998/miR-330-5p分子轴对口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭发挥抑制作用，这揭示了山慈菇提取物的抗癌机制，为开发山慈菇提取物成为口腔鳞癌化疗药物提供了实验依据。