miR-146a/TRAF6信号通路在NSCLC组织中的表达及临床病理意义

米热尼沙·阿不都热西提，帕提古丽·亚森，古再丽努尔·艾麦提

(新疆维吾尔自治区喀什地区结核病防治所暨肺科医院呼吸内科，新疆维吾尔自治区 喀什地区 844000)

非小细胞肺癌(NSCLC)是世界上最常见的癌症类型，约占肺癌患者的80%～85%[1-2]。疾病早期诊断对于患者手术后的良好预后至关重要，因此发现和识别新的生物标志物用于NSCLC的预测、诊断、预后预测和靶向治疗，从而获得更有效的治疗、降低病死率，是非常必要及迫切的。

微小RNA(miRNAs)通过直接结合靶基因的3′非翻译区(3′UTR)参与各种生理或病理过程的调控，导致信使RNA(mRNA)降解或翻译抑制[3]。与蛋白编码基因类似，miRNAs也可以作为癌基因或抑癌基因，成为潜在的预后生物标志物。miR-146a作为一种与常见癌症有关的miRNA，与多种癌症进展有正相关或负相关性[4]，然而其在NSCLC研究中却存在一定的争议。样本容量、癌症亚型和分期、患者背景、检测方法，甚至miRNA-146b代偿，都可能是导致研究结果混乱的原因，因此有待进一步丰富临床循证数据。一项女性肺癌队列研究[5]发现miR-146a rs2910164位点CG或GG基因型与肺癌风险较低有关，这可能是由于突变型基因与其靶基因肿瘤坏死因子-α受体相关因子6(TRAF6)的结合减少所致。TRAF6是miR-146a的下游效应器，在癌症发生、侵袭和转移中具有多效性作用。本研究旨在评估miR-146a/TRAF6通路与NSCLC患者临床病理参数及预后的潜在关系，从而为寻找有效的生物学靶点提供新的证据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取新疆维吾尔自治区喀什地区结核病防治所暨肺科医院2009—2017年手术切除的53例非癌肺组织(Non-CLT)和118例NSCLC组织。Non-CLT和NSCLC患者均未接受过放疗或化疗，且均经组织学确诊。NSCLC患者中位年龄67.0岁，男90例，女28例；TNM分期Ⅰ期25例，Ⅱ期25例，Ⅲ期68例；腺癌54例，鳞癌64例。Non-CLT患者中位年龄64.0岁，男27例，女26例。Non-CLT和NSCLC患者年龄和性别构成基本一致(P>0.05)，具有可比性。与本研究相关的方案均经本院人类实验机构与伦理委员会批准。所有受试者术前均知情同意。

1.2 实时荧光定量PCR法检测组织miR-146a表达

采用RNAiso Plus总RNA提取试剂盒(大连Takara公司)提取石蜡包埋组织中总RNA。用光谱仪检测到的A260/A280比例为1.9～2.1，质量浓度≥0.1 μg·μL-1。采用Hairpin-it microRNA和U6 snRNA标准化RT-PCR定量试剂盒(上海基因药业有限公司)将总RNA(1～3 μg)转化为cDNA。每个样本均在逆转录后，在ABI 7500热循环仪(美国Thermo Fisher scientific公司)上进行一式3份的定量PCR反应。热循环条件为：95 ℃ 3 min；40次循环，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s。所有数据用2-ΔΔCT法进行分析。miR-146a引物：(正向)5′-UGAGAACUGA-AUUCCAUGGGUU-3′，(反向)5′-ACTCTTGAC-TTAAGGTACCCAA-3′；U6引物：(正向)5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′，(反向)5′-AACGCTTC-ACGAATTTGCGT-3′。

1.3 免疫组织化学法检测组织TRAF6蛋白表达

根据既往的实验室经验调整抗体的染色条件。所有石蜡标本均切成4 μm连续(≥3片)切片。切片贴在载玻片上，在恒温器(60 ℃)中加工60 min。分别用于病理染色、TRAF6抗体免疫组织化学染色(IHC)和阴性对照。采用两步法进行IHC染色，石蜡包埋切片用二甲苯脱蜡，用一系列降低乙醇浓度的溶液进行再水化。切片置于沸腾柠檬酸缓冲液中(抗原修复)，3%H2O2用于抑制内源性过氧化物酶活性。用TRAF6(1∶300稀释，sc-8409，美国Santa Cruz Biotechnology公司)初级抗体在4 ℃条件下孵育隔夜，次日用兔特异性IHC HRP/DAB试剂盒(ab209101，美国Abcam公司)在室温下孵育10 min，苏木精反染30 s。用光学显微镜获得图像。病理学家对IHC染色进行盲法评估。根据阳性细胞百分比分别评为0(0%)、1(1%～25%)、2(26%～50%)、3(51%～75%)和4(76%～100%)分。根据染色强度分别评为0(阴性)、1(轻度表达)、2(中度表达)和3(强表达)分。每个病例的最终病理评分用百分比和强度评分相乘得出。积分大于2的染色被认为阳性(图1)。

图1 IHC法检测Non-CLT、肺腺癌、肺鳞癌组织中TRAF6蛋白表达(×200)

1.4 统计学方法

应用SPSS24.0软件进行统计学分析。组织miR-146a相对表达量不符合正态分布，用中位值(四分位距)表示，组间比较采用Mann-WhitneyU分析。采用卡方检验分析NSCLC与Non-CLT蛋白表达的差异，并采用卡方检验分析miR-146a、TRAF6蛋白与NSCLC临床病理特征的关系。对指标之间的相关性进行Spearman秩相关性分析。生存率采用Kaplan-Meier分析，生存率曲线的比较采用log-rank检验。采用Cox比例风险回归模型评估独立的预后因素。以P<0.05(双侧)为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-146a和TRAF6蛋白表达差异

与Non-CLT组织相比，NSCLC组织中miR-146a 相对表达量降低[0.550(0.485，0.650)比0.994(0.830，1.121)，Z=-7.847，P<0.001]。TRAF6在肺腺癌和肺鳞癌组织中的阳性表达率分别为57.41%(31/54)和59.38%(38/64)，Non-CLT组织中TRAF6蛋白阳性表达率为26.42%(14/53)，TRAF6在肺腺癌和肺鳞癌组织中的阳性表达率高于Non-CLT组织(χ2=15.091，P<0.001)。见图2A。

2.2 miR-146a和TRAF6蛋白表达的相关性

在NSCLC组织中，TRAF6蛋白阴性表达组织中miR-146a相对表达量高于TRAF6蛋白阳性表达组织[0.585(0.550，0.765)比0.515(0.435，0.580)，Z=-4.801，P<0.001，图2B]。NSCLC组织中miR-146a相对表达量与TRAF6蛋白IHC评分呈负相关性(rs=-0.515，P<0.001，图2C)。

A：肺腺癌和肺鳞癌与Non-CLT组织中miR-146a表达差异；B：TRAF6蛋白阳性表达和阴性表达组织中miR-146a表达差异；C：组织miR-146a和TRAF6蛋白表达的关系。

2.3 miR-146a和TRAF6蛋白表达与临床病理特征的关系

根据NSCLC组织miR-146a相对表达量的中位值，miR-146a≤0.550为低表达、>0.550为高表达。TNM分期Ⅲ期患者miR-146a低表达率高于TNM分期Ⅰ—Ⅱ期患者，而TRAF6阳性表达率显著高于TNM分期Ⅰ—Ⅱ期患者(P<0.001)。伴有淋巴结转移的NSCLC患者miR-146a低表达率及TRAF6阳性表达率均高于无淋巴结转移者(P<0.001)。与TNM分期Ⅰ—Ⅱ期或无淋巴结转移的NSCLC患者相比，TNM分期Ⅲ期及伴淋巴结转移患者的miR-146a低表达/TRAF6阳性表达率较高(P=0.006，P<0.001)。患者miR-146a低表达、TRAF6阳性表达单独或联合表达模式的生存率低于其他表达模式的患者(P<0.05)。见表1。

表1 miR-146a和TRAF6蛋白表达与NSCLC临床病理特征的相关性分析 n(%)

2.4 miR-146a、TRAF6表达状态对患者预后的影响

miR-146a低表达(P=0.012)或TRAF6阳性表达(P=0.017)的肺腺癌患者的总生存率较低(图3A)；TRAF6阳性表达与肺鳞癌患者总生存预后不良有关(P=0.007)(图3B)。在联合情况下，miR-146a低表达/TRAF6阳性表达的肺腺癌和肺鳞癌患者总生存率低于其他患者(P=0.003，图3A；P=0.012，图3B)。

A：肺腺癌患者;B：肺鳞癌患者。

2.5 影响NSCLC患者总生存预后的临床因素分析

单因素/多因素Cox比例风险模型分析，只有TNM分期是肺腺癌患者的独立预后因素(P<0.05，表2)；组织TRAF6阳性表达和淋巴结转移是肺鳞癌患者的独立预后因素(P<0.05，表3)。

表2 肺腺癌患者总生存预后的单因素/多因素Cox比例风险模型分析 n=54

表3 肺鳞癌患者总生存预后的单因素/多因素Cox比例风险模型分析 n=64

3 讨论

肺癌是最具杀伤力和侵袭性的恶性肿瘤之一[6]。随着基因组和基础研究的发展，越来越多的细胞分子生物标记物被认为是肺癌的特异性诊断和靶向治疗分子。此外，肺癌的发生是一个多步骤的过程，但癌变机制尚不完全清楚。因此，众多研究都在努力寻找可靠的分子标志物。本研究旨在探讨miR-146a/TRAF6通路在NSCLC诊断和预后预测中的潜在作用。

大多与miR-146a相关的研究[7]表明，miR-146a在恶性肿瘤中具有抑癌因子的活性。例如在NSCLC细胞系和组织样本中，miR-146a的表达被强烈下调，并且在肺癌细胞系中显示出抗增殖和抗凋亡的特性[8-10]，这与本研究结果基本一致。TRAF6是核因子κB(NF-κB)的关键激活因子。STARCZYNOWSKI等[11]已经确定TRAF6是肺癌细胞11p13号染色体上扩增的候选癌基因之一，其过表达可导致成纤维细胞的恶性转化和肿瘤的形成，而敲除TRAF6表达则可抑制下游NF-κB信号的激活，进而影响人肺癌细胞的生长和肿瘤的形成。此外，有学者发现利用干扰小RNA抑制RAS介导的肿瘤形成过程中，TRAF6的缺失可能对人类肺癌有重要意义[12]。Kras是肺癌中最常见的突变癌基因之一，然而，抑制RAS的有效疗法并不存在。因此，将TRAF6作为RAS肿瘤发生的下游效应因子，可能为治疗干预提供一个替代靶点。本研究发现NSCLC中miR-146a表达量普遍降低，且多数组织TRAF6呈阳性表达。miR-146a、TRAF6单独或联合表达异常的NSCLC患者总生存时间明显较短。而TRAF6蛋白阳性表达可能是肺鳞癌患者预后不良的独立影响因子。本研究结果表明，NSCLC中miR-146a表达降低，同时TRAF6表达显著增加，这与既往研究[8-12]结果一致。此外，miR-146a、TRAF6在临床晚期患者中的表达变化更明显，为其在NSCLC肿瘤发生进展中的作用提供了进一步的证据，而且两者在癌变过程中具有明显的靶向调控作用。对于NSCLC患者，TRAF6蛋白表达与miR-146a相对表达量呈一定的负相关性。

NSCLC患者中TRAF6蛋白表达阳性和阴性组织，其miR-146a相对表达量均低于Non-CLT组织，说明TRAF6不是miR-146a的唯一调控因子，miR-146a还可能通过影响其他癌基因或抑癌基因的表达影响NSCLC进程。例如HUANG等[13]通过靶向扫描、荧光素酶检测、癌症基因组图谱等研究方法证明，miR-146a-5p能够直接靶向于肿瘤胶原酶刺激因子(TCSF)，进而触发成纤维细胞内许多基质金属蛋白酶的表达，从而调节NSCLC细胞的存活和凋亡机制。巨噬细胞移动抑制因子(MIF)被认为是调节天然免疫的重要细胞因子，MIF通过激活NF-κB炎症信号转导途径进而促进肺癌细胞Warburg效应[14]。在NSCLC中上调的MIF基因也被证实是miR-146a的反向靶点。此外miR-146a也通过特异性下调CCND1/2的表达，减缓细胞周期进程，并通过抑制胰岛素受体底物2(IRS2)的转录和翻译而阻碍上皮细胞向间充质细胞的转化，这些都是miR-146a发挥抑癌因子活性的重要机制[15]。本研究发现，miR-146a和TRAF6在NSCLC组织中的表达呈正相关性，两者联合表达异常的患者总生存率低于其他表达模式的患者。本研究结果提示miR-146a/TRAF6通路在NSCLC发生、进展中发挥着关键作用，有可能成为NSCLC诊断和治疗的重要分子标志物，但是miR-146a的调控网络非常复杂，miR-146a、TRAF6之间是直接还是间接的靶向关系机制仍有待进一步研究。

综上所述，NSCLC组织中miR-146a表达降低，可能具有一定的抑癌因子活性；同时TRAF6蛋白表达显著升高。miR-146a/TRAF6通路可能在NSCLC的发展中发挥着重要作用，有望成为预测NSCLC患者预后不良的潜在生物标志物和将来靶向制剂研发的有效靶点。