谷氨酸通过调控脊髓背角GABABR2参与慢性胰腺炎痛的机制研究

徐卉红，邱海波，王莉琴，朱成成，陆智杰

(1.海军军医大学第三附属医院麻醉科，上海 200438； 2.中国人民解放军海军第九0五医院麻醉科，上海 200052)

反复发作的腹痛是慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)患者主要的临床症状，疼痛管理成为治疗CP的核心[1]。传统理论认为，胰腺自身病变是疼痛的主要来源，但基于这一理论建立的内镜或手术治疗对CP痛的缓解不尽人意[2]。有研究[3-5]认为，CP患者的脑岛、继发性躯体感觉皮层及扣带回皮层发生重构，下行抑制疼痛调节受损。定量感觉测试结果显示约50%的CP痛患者存在中枢敏化[6]，手术或去内脏神经治疗对缓解疼痛十分有限[7]。提示中枢敏化可能是难治性CP痛发生的重要机制。

脊髓背角是外周伤害信息向中枢传递的第一站。GABA在脊髓背角中广泛表达，作为GABA发挥作用的受体之一GABABR(GABABreceptor)也在脊髓表达，并且与疼痛的调控密切相关。当脊髓背角GABABR激活后，与外周伤害感受密切相关的Aδ纤维和C纤维的活性降低；神经递质谷氨酸(Glu)、P物质、钙基因相关肽等伤害性物质的释放减少[8-9]。有研究[10]表明，正常大鼠鞘内给予GABABR激动剂后，大鼠伤害阈值增加；而给予GABABR拮抗剂后，大鼠会出现痛觉异常和痛觉过敏。可见，脊髓背角GABABR表达失调导致GABA的抑制效应减弱是疼痛传导的重要机制。

GABABR是由GABABR1和GABABR2两个亚单位组成的异二聚G蛋白偶联受体[11]。链唑霉素诱导的糖尿病神经病理性疼痛模型大鼠脊髓背角处GABABR1表达下调[10]，但未研究GABABR1下调的机制。此外，有研究[12]显示，体外培养的海马神经元和大脑皮层神经元细胞膜上GABABR的下调，主要是由Glu介导非其自身配体GABA所致。但是，Glu调控脊髓背角GABABR2参与CP痛并不明确，本研究将着重探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DBTC、1% Triton-X100、DAPI、抗IB4抗体(美国Sigma公司)；RIPA细胞裂解液(美国Thermo公司)；正常山羊血清封闭液(博士德生物工程有限公司)；抗GABABR2抗体、抗MAP2抗体(美国Abcam公司)；抗GAPDH抗体(天津三箭公司)；胰酶(上海化学试剂公司)；荧光二抗、多聚-L-鸟氨酸、0.05%EDTA、Neurobasal培养液、DMEM高糖培养液、神经生长因子B27、L-谷氨酰胺、青链霉素双抗、F12、FBS胎牛血清(美国Invitrogen公司)；Sulfo-NHS-LC-Biotin(磺酸基-NHS-生物素)、High Capacity Neutr Agarose Resin(高结合能力中性亲和素琼脂糖树脂)(美国Thermo Scientific Pierce公司)。

1.2 主要仪器

常规手术精细解剖器械一套(美国WPI公司)；垂直洁净工作台(上海博讯实业有限公司)；体视解剖显微镜、荧光显微镜(德国Leica公司)；Von Frey电子测痛仪(美国IITC公司)；CO2培养箱(日本三洋公司)；JY92-IIN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；LHR体外灌流泵(上海医疗器械厂)；Western-blot电泳系统、Western Blot转膜系统(美国Bio-Rad公司)；热电台式多用冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司)；Image Quant LAS4000化学发光成像仪(通用电气健康护理生物科学股份公司)。

1.3 实验动物与CP模型的构建

200 g左右的Wistar雄性大鼠共42只，购于上海斯莱克动物实验有限公司。实验动物的使用处理经海军军医大学伦理委员会批准。实验在海军军医大学第三附属医院麻醉科实验室进行。

CP模型的构建参照文献[13]。腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液(50 mg·kg-1)，大鼠麻醉后经尾静脉注射DBTC溶液(8 mg·kg-1DBTC，溶剂为2:3的甘油和无水酒精)。建模成功的大鼠为CP组(n=30),其中，6只建模后用于行为学检测，并于术后21 d取脊髓用于免疫荧光实验；24只在DBTC注射后3、7、14、21 d用于Western-blot实验，每个时间点6只大鼠。对照组12只仅注射等剂量溶剂，其中6只用于行为学检测，完成行为学实验后取脊髓用于免疫荧光实验；6只用于Western-blot实验取材。

1.4 腹部机械痛的测定

腹部机械痛的测定参考Randall-Sellito法[14]。测试前3 d将大鼠放在有机玻璃箱(22 cm×22 cm×30 cm)中适应30 min·d-1。测试当天大鼠适应同前，用Von Frey电子测痛仪探头逐渐加压大鼠左上腹部。当大鼠抬腹、走开或腹肌收缩时停止加压，记录此时数值。每只大鼠测3次，每次间隔10 min。腹部机械痛阈值为3次平均值。

1.5 免疫荧光组织化学法

脊髓组织切成20 μm厚度，0.01 mol·L-1PBS漂洗15 min×3次后用(1%NGS+1% Triton-X100+0.01 mol·L-1PBS)室温封闭2 h。4 ℃孵育一抗(抗GABABR2抗体，1:1000；抗IB4抗体，1:1000)24 h。0.01 mol·L-1PBS漂洗15 min×3次。室温避光孵育1:2000的二抗(羊抗兔:Alexa Fluor 488，羊抗小鼠：Alexa Fluor 588)2 h。

1.6 脊髓背角神经元原代培养

脊髓背角神经元的培养参照文献[15]。多聚-L-鸟氨酸包被6孔细胞培养板。取胎龄13 d大鼠脊髓背角，并剪成1 mm3大小。用2 mL含0.05%EDTA的胰酶37 ℃消化15 min后用含78%DMEM、10%FBS、10%F12、1%青链霉素双抗、1%L-谷氨酰胺的完全培养液终止消化。重悬后0.07 nm细胞滤膜过滤，1000 次·min-1离心5 min去上清。加入培养液重悬沉淀后种于细胞培养板。接种密度为5×105孔-1，置于37 ℃、5%CO2的培养箱。每 3～4 d半量换细胞培养液。

1.7 细胞膜蛋白的提取

原代培养的脊髓背角神经元分别用20、40 μmol·L-1的Glu孵育30 min后，提取细胞膜蛋白。脊髓背角神经元加入含0.5 mg的Sulfo-NHS-LC-biotin溶液2 mL(pH=8.0)，4 ℃30 min。用30 μL 1 mol·L-1glycine(pH=7.4)中止生物素反应。RIPA裂解液裂解45 min，13 000 次·min-14 ℃ 离心15 min，取上清。取一部分用于直接加入SDS上样缓冲液，100 ℃×5 min，用于测定总蛋白浓度；剩余部分用与连接了亲和素的琼脂糖树脂磁珠(Neutr Avidin beads)处理。4 ℃冰箱过夜后10 000 g 离心3 min。将离心沉淀物Neutr Avidin beads用4 ℃ PBS溶液洗涤5次，10 000 g离心 1 min，沉淀物加入SDS上样缓冲液，100 ℃×5 min，即得细胞膜蛋白。

1.8 Western-blot实验

组织蛋白提取按前法所述[16]。蛋白经5%浓缩胶和10%分离胶后，转到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶+5%BSA的TBST溶液室温封闭2 h。4 ℃孵育一抗(抗GABABR2抗体1:1000；抗GAPDH抗体1:2000)，24 h。室温孵育二抗(羊抗兔，1:5000)2 h。ECL显影。Image J分析定量。

1.9 细胞免疫荧光法

4%PFA固定培养7 d的脊髓背角神经元。0.01 mol·L-1PBS漂洗3次，用10%NGS+1%Triton-X100的0.01 mol·L-1PBS溶液室温封闭2 h。4 ℃孵育一抗GABABR2抗体(1:500)及抗MAP2抗体(1:500)，24 h。室温避光孵育二抗1:2000(羊抗兔:Alexa Fluor 488，羊抗鼠：Alexa Fluor 588)2 h。

1.10 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件分析，数据以均数±标准差表示。大鼠腹部机械痛阈值采用重复测量方差分析。Western-blot实验结果对照组为数值1，其他组测定数值为与对照组的相对值。多组间的均数分析采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠CP模型及腹部机械痛的测定

CP模型大鼠胰腺HE染色可见散在的胰腺细胞肿胀坏死，广泛的炎症细胞浸润及大量的纤维结缔组织增生(图1)。腹部机械痛测定结果显示：与对照组相比，在DBTC单次尾静脉注射后，大鼠对腹部机械刺激敏感性明显增强(图2),说明CP大鼠痛阈明显降低。

A:对照组；B:DBTC注射21 d。

1—4：依次为DBTC注射3、7、14、21 d。

2.2 大鼠脊髓背角GABABR2的分布和表达

免疫荧光法检测显示GABABR2主要表达在脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层。同时，GABABR2与伤害感受神经元标记物IB4共染结果显示，GABABR2在伤害感受神经元中广泛表达(图3)。这提示脊髓背角GABABR2可能参与疼痛的调控。

2.3 CP大鼠脊髓背角GABABR2表达的变化

与对照组比较，CP组大鼠在DBTC注射后3、7、14、21 d时GABABR2的相对表达分别为(105.70±17.78)%(P=1.000)、(53.82±12.40)%(P<0.001)、(53.01±13.01)%(P<0.001)、(48.04±9.31)%(P<0.001)，见图4A。结果显示CP大鼠脊髓背角GABABR2的表达明显减少。同时，免疫荧光组织化学法结果也显示DBTC注射21 d大鼠脊髓背角处GABABR2的表达显著下降(图4B)。

1：对照组；2—5：依次为DBTC注射3、7、14、21 d。*P<0.001与对照组比较。

2.4 Glu对脊髓背角神经元GABABR2表达的影响

脊髓背角神经元培养7 d后，进行GABABR2和神经元标记物MAP2的共染。结果显示，GABABR2在体外培养的脊髓背角神经元上表达广泛(图5A)。用20和40 μmol·L-1的Glu刺激体外培养7 d的脊髓背角神经元30 min。Western-blot结果显示，GABABR2的相对表达分别为(55.01±7.51)%(P<0.001)和(46.28±7.70)%(P<0.001)，差异具有统计学意义(图5B)。结果提示，Glu可能通过调控GABABR2参与慢性胰腺炎痛。

A:蓝色为细胞核标记物DAPI，绿色为GABABR2，红色为神经元标记物MAP2，黄色为共标；B：1为对照组；2为Glu 20 μmol·L-1;3为Glu 40 μmol·L-1。*P<0.001，n=6。

3 讨论

CP痛的发生机制尚不明确。本研究结果表明，CP大鼠腹部机械痛阈值明显下降(P<0.001)；DBTC注射7 d后大鼠脊髓背角GABABR2的表达显著下降(P<0.001)；Glu刺激脊髓背角神经元后GABABR2的表达下调(P<0.001)。LÜTT等[13,17]的研究表明，单次尾静脉注射DBTC后24 h内诱发急性水肿性胰腺炎和胆胰管扩张。注射DBTC 7 d后胰腺呈现慢性胰腺炎的病理特征(胰腺组织内可见广泛的单核细胞浸润和坏死纤维化形成)，并持续2个月。该模型不但操作简单，且能很好地模拟人慢性胰腺炎的发病过程。本实验利用该方法建立CP模型大鼠的胰腺形态学结果与此相似。

本研究显示GABABR2主要表达在与疼痛密切相关的脊髓背角浅层，这一结果与前期的研究[18-19]一致。同时笔者检测到CP模型大鼠脊髓背角中GABABR2的表达显著下降(P<0.001)。本实验未具体研究GABABR2在哪一类神经元上减少，主要是因为GABABR2在脊髓背角处分布广泛，其发挥功能可以通过突触前、突触后和突触外机制。脊髓背角处给予GABABR2激动剂可以产生突触前和突触后抑制，阻断初级感觉神经末梢释放Glu、P物质及钙基因相关肽[9,20]。鞘内给予GABABR2拮抗剂phaclofen诱导触摸痛和温觉痛[21]。脊髓处而非延髓头端腹内侧区给予选择性的GABABR2拮抗剂CGP 35348可以阻断baclofen的镇痛效应[22]，这进一步提示脊髓处GABABR2的功能与疼痛的发生密切相关。因此，本研究结果提示脊髓背角处GABABR2下调是导致CP痛的一个重要机制。

调控细胞膜上受体表达的机制包括基转录、翻译和受体磷酸化等修饰、受体的降解、重新分布及与配体的结合能力等。有研究[12,23]显示，中枢神经系统GABABR主要存在于兴奋性神经元上，与谷氨酸能神经元密切相关。海马和大脑皮层神经元GABABR2的表达并不受其自身配体GABA的影响，而是由Glu通过调控GABABR2的内吞，导致细胞膜GABABR的表达减少。本研究结果显示，20和40 μmol·L-1Glu刺激体外培养7 d的脊髓背角神经元30 min后，细胞膜上GABABR2的表达较未处理组显著下降(P<0.001)，与以往的研究[12,23]结果一致。本研究未检测CP模型大鼠脊髓背角Glu水平，但已有文献[7,24]证实，Glu通过激活N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受体参与CP痛患者中枢敏化过程，CP痛患者给予NMDA受体拮抗剂S-氯胺酮后，疼痛显著缓解。CP痛患者扣带回皮层Glu的水平增加与疼痛密切相关[25]。本研究为Glu在CP痛的发生中提出了另一机制。

总之，Glu通过调控脊髓背角GABABR2的表达参与慢性胰腺炎痛的发生。这一结果为缓解慢性胰腺炎痛提供了新的中枢敏化机制。