Elabela活性片段ELA14在对比剂致大鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用机制

孟丹心，李益民，美合日阿依·约麦尔，陆治平，黄 进

0 引 言

在临床诊疗过程中使用碘对比剂(contrast media，CM)后发生的急性肾功能损害称对比剂致急性肾损伤(contrast induced acute kidney injury，CI-AKI)[1-2]。目前，CI-AKI是医院获得性急性肾损伤第3个最常见原因，约占医院获得性肾衰竭患者的11%[3-4]。研究表明，CI-AKI的主要发病机制包括：对比剂的直接细胞毒性、ROS过度生成和肾髓质缺血[5-6]。然而，除水化和改用低渗/等渗对比剂外，目前仍无确切防治CI-AKI的方法[7-8]。因此，有效防治CI-AKI是临床医师共同面临的重大挑战。

Elabela(ELA)是Chng等[9]在2013年发现的关于血管紧张素样受体(putative receptor protein related to the type-1 angiotensin receptor，APJ)的一种新型内源性配体，在成人肾中高表达[10-11]。ElA含54个氨基酸，可分割为含32个氨基酸的成熟肽(ELA32)和一个信号肽[12]。在所有脊椎动物中，ELA32多肽的最后13个氨基酸高度保守，可继续切割为ElA32、ElA22和ElA14等含有保守序列的生物活性片段[13-15]。研究表明ELA多肽可显著降低肾缺血/再灌注损伤中肾小管细胞的炎性反应、DNA损伤及细胞凋亡[9,16-18]。体外实验中，已证实ELA32在对比剂致肾小管上皮细胞损伤中具有保护作用，但降解后的ELA14片段在CI-AKI中的作用尚不明确。因此，本研究通过建立碘普罗胺(Iopromide，IOP)肾小管上皮细胞CI-AKI模型，观察ELA14是否具备与ELA32相似的保护能力。

1 材料与方法

1.1 材料大鼠NRK-52E细胞(上海中科院细胞库)；ELA14、ELA32(R&D公司美国)，ELISA试剂盒、PCR试剂盒(Cusabio公司中国)，Caspase3、P-ATR、p-CHK抗体(Proteintec公司中国)，CCK-8试剂(Dojindo实验室日本)；流式细胞仪、电泳仪(BD公司德国)，荧光定量仪(Applied biosystems公司美国)。

1.2方法

1.2.1 筛选IOP及ELA多肽干预浓度用(0、25、50、100、150、200、250)mgI/mL的IOP及(0、300)pmol/L、(3、30、300)nmol/L、(3、15)μmol/L的ELA多肽干预NRK-52E细胞。CCK-8法测定细胞活性，选出IOP及ELA多肽的作用浓度。最终，IOP选用50%IC50值21 mgI/mL，ELA多肽选用30 nmol/L、3 μmol/L作为干预浓度。

1.2.2细胞分组对照组(正常培养的细胞)；IOP组(加入21mgI/mL IOP)；ELA32低剂量组(IOP组+30 nmol/L ELA32)；ELA32高剂量组(IOP组+3 μmol/L ELA32)；ELA14低剂量组(IOP组+30 nmol/L ELA14)；ELA14高剂量组(IOP组+3 μmol/L ELA14)。

1.2.3流式细胞术检测将细胞移入流式检测管，1000 r/min离心5 min，弃上清，用Binding Buffer 500 μL重悬细胞后加5 μL Annexin V-EGFP混匀，室温遮光反应20 min，再加入5 μL PI混匀，置于培养箱孵育5 min后上机检测。

1.2.4线粒体活性氧测定PBS洗涤细胞，线粒体探针工作液孵育后，用4%多聚甲醛固定，洗涤后加入DAPI，最后加一滴抗荧光淬灭封片液，盖盖玻片避光保存，上镜观察并采集图片。

1.2.5ELISA检测将100 μL标准品和100 μL样品加入细胞中孵育2 h，洗涤后依次加入稀释抗体、酶标抗体和底物液显色孵育2 h，加入终止液；上机检测并记录450 nm吸光度。

1.2.6定量PCR用TRIzol提取总RNA，进行逆转录，按照qPCR试剂盒说明加入引物进行荧光定量。计算结果，以内参为标准，用2-ΔΔCt法算出细胞mRNA表达量[19]。引物 ：NRF2基因，Forward PrimerGAGAAAACGACAGAAACCTCCAT，Reverse Primer TGTATCTGGCTTCTTGCTCTTGG；ICAM-1基因，Forward Primer CTGGAGAGCACAAACAGCAGAGAT，ReversePrimer ATGGGAGCTGAAAAGTTGTAGATTC；R-GAPDH基因，Forward Primer TATGTCGTGGAGTCTACTGGCGTCT，Reverse Primer AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG。

1.2.7蛋白免疫印迹提取总蛋白并测定浓度，煮沸后用SDS-PAGE法分离蛋白，将蛋白转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，并与caspase3、P-ATR、P-CHTL和β-actin一抗在4 ℃下孵育过夜。用TBS-T洗涤后放入二抗中孵育。TBST洗涤，滴加显影剂曝光，统计并分析结果。

2 结 果

2.1 ELA14干预可改善IOP引起的细胞凋亡与对照组相比，IOP干预后细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。相比IOP组，不同剂量ELA14和 ELA32均使细胞凋亡率下降，并都有剂量依赖性(P<0.05)；但同剂量ELA14组与ELA32组作用差异无统计学意义(P>0.05)。 见图1 。

1：对照组；2：IOP组；3：IOP+ELA32低剂量组；4：IOP+ELA32高剂量组；5：IOP+ELA14低剂量组;6：IOP+ELA14高剂量组

2.2ELA14干预可改善IOP引起的细胞炎症反应如表1，IOP干预后，上清液IL-6、TNF-a因子及细胞NRF2和ICAM-1mRNA表达较对照组显著升高(P<0.05)；与IOP组相比，不同剂量ELA14和ELA32均明显降低炎性因子并下调NRF2 mRNA表达(P<0.05)但同剂量ELA14与ELA32差异无统计学意义(P>0.05)。相比IOP组，高剂量ELA14可下调ICAM-1mRNA表达(P<0.05)，而低剂量ELA14无该作用(P>0.05)；不同剂量ELA32均可下调ICAM-1 mRNA表达，但高剂量ELA14与ELA32作用差异无统计学意义(P<0.05)。

表 1 各组细胞炎症指标检测

2.3ELA14干预可改善IOP引起的ROS生成与对照组相比，IOP组细胞内MitoSOX荧光信号明显增加(P<0.05)；与IOP组相比，不同剂量ELA14和ELA32均降低了MitoSOX荧光信号(P<0.05)，且均呈现剂量依赖性(P<0.05)；而同剂量ELA14与ELA32效果无明显差异(P>0.05)，见图2。

1：对照组；2：IOP组；3：IOP+ELA32低剂量组；4：IOP+ELA32高剂量组；5：IOP+ELA14低剂量组;6：IOP+ELA14高剂量组

2.4ELA14干预可改善IOP引起的细胞凋亡、DNA损伤相关蛋白表达与对照组相比，IOP组中细胞caspase3/C-caspase3凋亡蛋白及p-ATR和p-CHK1 DNA损伤蛋白表达上调；ELA14干预可下调C-caspase3表达并呈剂量依赖性(P<0.05)，不同剂量ELA32干预呈现相似演变。与IOP组相比，高剂量ELA14可下调P-ATR和p-CHK1表达(P<0.05)，低剂量ELA14未能显著下调p-CHK1(P>0.05)；不同剂量ELA32均可下调P-ATR和p-CHK1蛋白(P<0.05)，但高剂量ELA14与ELA32对细胞的保护作用相同(P<0.05)。见图3。

1：对照组；2：IOP组；3：IOP+ELA32低剂量组；4：IOP+ELA32高剂量组；5：IOP+ELA14低剂量组;6：IOP+ELA14高剂量组

3 讨 论

碘对比剂是X线下心血管显影的基本用药，其以非离子形式从肾清除，可诱发急性肾损伤[20-21]。本研究选用低渗对比剂IOP，构建了NRK-52E细胞CI-AKI模型，并发现Elebela的另一活性片段ELA14对肾损伤的保护作用与ELA32相当，同样可减少IOP诱导的ROS生成及DNA损伤等途径，来降低NRK-52E细胞凋亡。

在20世纪中期，已发现碘对比剂对细胞有毒性作用[22]。本课题组前期研究提示[23]：等渗对比剂碘克沙醇可加剧细胞氧化应激、线粒体损伤等途径，增加NRK-52E细胞凋亡和自噬。本研究中，低渗对比剂IOP干预后，NRK-52E细胞中炎症因子IL-6、TNFa、NRF2及ICAM-1表达及ROS生成明显增多；同时DNA凋亡和损伤基因Caspase、p-CHK1、p-ATR表达也明显上调，表明低渗对比剂同样能通过线粒体损伤、氧化应激、DNA损伤等多个途径，增加NRK-52E细胞凋亡。

ELA32-AA成熟肽在体内高度保守，末端13个氨基酸在脊椎动物中保持稳定[24]。目前，ELA片段活性及其生理作用成为研究热点。Xi等[25]表明：重组的外源性ELA21在血浆中的半衰期显著延长，并可改善心肌梗死大鼠模型的心脏功能。研究表明，ELA32在体内主要依赖ELA14活性片段激活APJ受体而发挥作用[26]，且ELA14比ELA32和Apelin13更能有效促进动物肾代谢；ELA11 (不包含完整13个残基)在缺氧/复氧损伤中具有肾小管细胞保护作用，并可使细胞免受阿霉素诱导的DNA损伤[27]。本研究中，ELA14与ELA32作用相当，同样能抑制IOP诱导的氧化应激炎症反应及DNA损伤，并减少细胞凋亡，可作为替代ELA32治疗心肾疾病的关键短肽。