S1PR5激动剂减轻H2O2诱导的脑微血管内皮细胞高通透性及氧化应激损伤

李星阅，任自敬，王 越，樊瑞雪，周佩洋

0 引 言

脑卒中因其高发病率、致死率和致残率成为我国第二大致死病因，其中缺血性卒中约占脑卒中的80%，严重威胁着我国居民的身体健康[1]。在急性缺血性卒中(acute ischemic stroke，AIS)发生过程中，脑组织迅速缺血缺氧，使神经元、小胶质细胞、星型胶质细胞等更多地进行无氧代谢合成能量，导致细胞内氧化应激水平升高[2]。大量活性氧、炎性因子等有害物质损伤血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)完整性，导致外周毒性细胞和分子进入大脑加重脑损伤[3]。再灌注治疗会因血脑屏障损伤出现脑水肿和出血性转化的严重并发症。因此，减轻血管内皮细胞氧化应激引起的损伤，对于保护AIS血脑屏障功能、减轻神经功能损伤至关重要。

鞘氨醇-1-磷酸酯受体5 (sphingosine 1-phosphate 5 receptor,S1PR5)是1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)的5个受体之一，在神经系统中主要分布在脑血管内皮细胞和胶质细胞，调节细胞的迁移、增殖、分化及存活，且与多发性硬化、亨廷顿病、年龄相关认知障碍等疾病的病理机制有关[4-6]。研究表明，在导致多发性硬化的中枢神经系统炎症中，S1PR5可维持血脑屏障完整性并减轻内皮细胞的免疫炎症反应[4]。在亨廷顿病动物模型中，S1PR5特异性激动剂A971432可通过调节Erk等途径保持血脑屏障的完整性[6]。但是S1PR5在AIS中的作用研究较少，S1PR5是否可在AIS的血脑屏障氧化应激损伤中发挥保护作用尚不清楚。本研究在体外利用H2O2处理脑微血管内皮细胞模拟AIS发生时的氧化应激环境，并给予S1PR5特异性激动剂A971432，研究激动S1PR5对氧化应激损伤脑微血管内皮细胞的影响，以期为临床上治疗AIS提供一定思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3(武汉普诺赛)。S1PR5特异性激动剂A971432(Tocris Bioscience)，过氧化氢(H2O2)和荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖(FITC-dextran)(Sigma)。Transwell小室(6.5 mm直径，0.4 μm孔径，聚碳酸酯)(Corning)。CCK-8试剂盒(Biosharp)。活性氧检测试剂盒(Applygen)。α-Tublin多克隆抗体(Sigma)，Bcl2多克隆抗体、ZO-1多克隆抗体、Occludin多克隆抗体、Nrf2多克隆抗体、HO-1多克隆抗体(Proteintech)，β-actin多克隆抗体、GAPDH多克隆抗体、S1PR5多克隆抗体、VE-Cadherin多克隆抗体、Erk1/2多克隆抗体及Bax多克隆抗体(Absin)，MMP-9多克隆抗体、p-Erk1/2多克隆抗体(CST)，SOD1及SOD2多克隆抗体(Santa Cruz)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，标记山羊抗兔/小鼠 IgG、Dy-Light 488 标记的山羊抗兔二抗(Abbkine)。SpectraMax i3x酶标仪(Molecular Devices)。电泳仪和转膜仪(Bio-Rad)。倒置荧光显微镜(Olympus)。

1.2方法

1.2.1 细胞培养用含10%胎牛血清(Gibico)的杜氏改良培养基(Gibico)培养单层bEnd.3，培养箱设置为37 ℃、5% CO2。在细胞处于生长对数期时(密度约为80%～90%)进行传代、铺板。

1.2.2细胞活力检测96孔板中接种bEnd.3细胞(6×103个/孔)，待细胞密度长至约80%进行实验：①参考文献[7]，用不同浓度的H2O2(0.5、1、2、4 mmol/L)处理1.5 h后，换成完全培养基培养24 h，根据细胞活力变化，确定H2O2浓度。②参考文献[4-5]，给予不同浓度A971432(1、5、10、20、50 μmol/L)单独处理bEnd.3细胞24 h，检测细胞活力变化。③A971432(5、10、20 μmol/L)预处理bEnd.3细胞24 h后，再给予H2O2处理1.5 h，检测细胞活力变化。

每次处理结束后，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h，酶标仪450 nm波长下测定光密度值(A)。每组设置5个复孔，重复3次。

1.2.3分组通过Western blot检测不同浓度H2O2对bEnd.3连接蛋白及氧化应激相关蛋白的影响。结合CCK8及Western blot结果筛选出H2O2适宜作用浓度为2 mmol/L，A971432适宜作用浓度为5、10、20 μmol/L。主要实验分为5组：对照组、H2O2组、H2O2+5 μmol/L A971432组、H2O2+10 μmol/L A971432组、H2O2+20 μmol/L A971432组。处理方式：5、10、20 μmol/L A971432预处理细胞24 h后，给予2 mmol/L H2O2处理1.5 h。

1.2.4血管内皮细胞通透性测定参考文献方法[7]测量血管内皮细胞通透性。将bEnd. 3细胞(1×105)接种在Transwell上室中，培养24 h。处理结束后，弃掉上下室培养基，均换成不含营养因子和血清的培养基，上室含终浓度为1 mg/mL的FITC-dextran (相对分子质量40 000)。37 ℃孵育，分别在0.5、1、1.5 h从下室中吸取100 μL液体置入不透光96孔板中，设置酶标仪波长为激发光490 nm，吸收光520 nm进行读数，根据各孔荧光强度来反映内皮通透性。不同时间点取完样后，补入等体积培养基。实验重复3次。

1.2.5Western blot分析处理结束后，弃掉培养基，PBS清洗后在冰上用含有蛋白酶抑制剂和PMSF的蛋白裂解液提取蛋白，BCA法测浓度，每组取30 μg蛋白进行电泳、转膜、5%牛奶封闭，一抗4 ℃孵育过夜(S1PR5，1∶800；Bax，1∶800；Bcl2，1∶1000；ZO-1，1∶1000；VE-Cadherin，1∶800；Occludin，1∶1000；Nrf2，1∶600；HO-1，1∶600；p-Erk1/2，1∶1000；Erk1/2，1∶1000；β-actin，1∶1000；GAPDH，1∶1000；α-Tublin，1∶3000)。次日，TBST洗膜3次，每次6 min，然后将膜与相应HRP标记的二抗室温下孵育1.5 h。TBST洗膜后，用ECL显色液显色，并用Image J软件对蛋白灰度值半定量分析。实验重复3次。

1.2.6免疫荧光染色处理结束后，PBS洗2遍，用预冷的4%多聚甲醛固定细胞25 min，PBS洗涤后室温封闭2 h(含1%羊血清的PBST)，与一抗4℃孵育过夜(ZO-1, 1∶300)。次日，回收一抗，PBS洗3遍，与Dy-Light 488二抗在室温下避光孵育2 h，PBS洗3遍后与DAPI孵育，于荧光显微镜下拍照。实验重复3次。

1.2.7活性氧检测处理结束后，弃掉培养基，PBS洗3遍，加入用无血清培养基稀释好的DCFH-DA探针(终浓度为10 μmol/L)，细胞培养箱孵育25 min，PBS洗3遍，然后用DAPI复染细胞核，PBS洗3遍后进行荧光检测。实验重复3次。

2 结 果

2.1 H2O2诱导bEnd.3细胞S1PR5表达下调Western blot结果显示，与对照组bEnd.3细胞的S1PR5蛋白表达 (1.00±0.01) 相比，H2O2组(0.59±0.03)明显降低(P<0.01)。

2.2激动S1PR5抑制H2O2诱导的血管内皮高通透性和相关蛋白的改变在1 h和1.5 h检测到，与对照组相比，H2O2组荧光值显著升高，内皮通透性增加(P<0.05)；与H2O2相比，H2O2+5、10、20 μmol/L A971432组的荧光值显著降低，提示A971432预处理减轻了H2O2诱导的内皮高通透性(P<0.05)，见图1。Westernblot结果显示，与对照组相比，暴露于H2O2的bEnd.3细胞ZO-1、VE-Cadherin、Occludin的表达显著下调(P<0.01)，MMP-9蛋白显著增加(P<0.01)；与H2O2组比，H2O2+5、10、20 μmol/L A971432组可以增加连接蛋白的表达水平(P<0.01)，降低MMP-9表达水平(P<0.01)，见图2。

与对照组比较，*P<0.05；与H2O2组比较，#P<0.05

1：对照组；2：H2O2组；3：H2O2+5 μmol/L A971432组；4：H2O2+10 μmol/L A971432组；5：H2O2+20 μmol/L A971432组

连接分子ZO-1的免疫荧光结果显示，对照组在细胞连接处连续分布而且荧光强度更高，H2O2损伤导致细胞膜上分布断续且整体荧光强度降低，而这一现象在H2O2+5、10、20 μmol/L A971432组中有所改善，见图3。

图 3 激动S1PR5抑制H2O2诱导的ZO-1荧光强度改变(×400)

2.3激动S1PR5抑制H2O2诱导的bEnd.3细胞凋亡与H2O2组[(75.33±3.76)%]相比，H2O2+10、20 μmol/L A971432组[(93.34±0.49)%, (100.60±7.29)%]可以明显逆转H2O2诱导的细胞活力下降(P<0.05)。Western blot结果显示，与对照组相比，H2O2组Bax/Bcl2比值和Caspase-3的表达明显升高(P<0.01)。与H2O2组相比，H2O2+5、10、20 μmol/L A971432组的Bax/Bcl2比值和Caspase-3表达显著降低(P<0.01)，见图4。选择对凋亡影响较大的20 μmol/L A971432研究通路相关蛋白，结果发现H2O2+20 μmol/L A971432组可以显著抑制H2O2诱导的p-Erk1/2与Erk1/2比值增高(P<0.01)，见图5。显微镜下观察各组细胞形态变化，与对照组比，H2O2处理后细胞明显回缩、形态不规则、排列疏松，且漂浮细胞增多。与H2O2组比，H2O2+5、10、20 μmol/L A971432组的细胞状态维持良好，漂浮细胞更少，见图6。

1：对照组；2：H2O2组；3：H2O2+5 μmol/L A971432组；4：H2O2+10 μmol/L A971432组；5：H2O2+20 μmol/L A971432组

1：对照组；2：H2O2组；3：H2O2+20 μmol/L A971432组

a：对照组；b：H2O2组；c：H2O2+5 μmol/L A971432组；d：H2O2+10 μmol/L A971432组；e：H2O2+20 μmol/L A971432组

2.4激动S1PR5通过上调Nrf2/HO-1通路减轻H2O2诱导的氧化应激反应图7显示，与对照组相比，H2O2组的Nrf2、HO-1、SOD1和SOD2蛋白表达显著下调(P<0.01)。与H2O2组比，H2O2+5、10、20 μmol/L A971432组可以显著增加Nrf2、HO-1、SOD1和SOD2蛋白表达水平(P<0.01)。

1：对照组；2：H2O2组；3：H2O2+5 μmol/L A971432组；4：H2O2+10 μmol/L A971432组；5：H2O2+20 μmol/L A971432组

DCFH-DA探针法检测细胞活性氧水平，如图8所示，与对照组相比，H2O2组中绿色荧光强度明显增加，代表细胞内的总活性氧含量显著升高。与H2O2组相比，给予5、10和20 μmol/L A971432预处理能显著降低细胞内绿色荧光强度，减少活性氧含量。

图 8 激动S1PR5降低H2O2诱导产生的细胞内总活性氧(×100)

3 讨 论

BBB主要由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMVECs)和邻近的血管周围细胞组成，是血液和大脑之间具有复杂结构的生化及物理屏障，在调节血源性分子进入大脑及维持神经传递所需的离子稳态微环境过程中发挥重要作用[8]。BBB的完整性受到BMVECs之间的紧密连接分子(Claudin-5、Occludin和ZO-1)和黏附连接分子(VE-Cadherin)调节[9]。在AIS期间，急剧增加的活性氧可直接或者间接破坏BBB的完整性导致外周毒性细胞和分子进入大脑加重脑损伤[10]。H2O2是一种具有代表性和稳定性的活性氧，本研究选用外源性H2O2处理bEnd.3细胞，模拟AIS发生后BBB所处的氧化应激环境。通过CCK8筛选发现2 mmol/L H2O2处理1.5 h能显著降低bEnd.3细胞活力(P<0.01)，升高胞内总活性氧水平，且明显减少ZO-1、VE-Cadherin和Occludin 的蛋白表达，是一种稳定有效的氧化应激模型。

S1P是一种具有多种生物活性的鞘磷脂代谢物，它通过结合5个受体(S1PR1-S1PR5)影响细胞的迁移、增殖、分化、存活等生物过程[11]。其中S1PR1、S1PR2和S1PR3在血管内皮细胞等多种细胞中表达，S1PR4主要在免疫细胞中表达，S1PR5在中枢神经系统中的脑微血管内皮细胞和神经胶质细胞分布较多[12-15]。在体外，激动S1PR5通过降低NF-κB活性来减少人脑微血管内皮细胞的免疫炎症反应，并可通过减少单核细胞跨内皮迁移来维持BBB完整性[4]；新型的S1PR5选择激动剂A971432可提高人脑微血管内皮细胞的内皮电阻进而影响内皮完整性[5]。长期低剂量服用A971432(0.1 mg/kg)可通过调节Akt和Erk等通路来减少亨廷顿模型小鼠的突变蛋白聚集并保持BBB完整性[6]。体内实验中，A971432(0.1 mg/kg)可有效改善小鼠与年龄相关的认知障碍[5]。研究显示，短暂性大脑中动脉缺血动物模型中，S1PR5在造模后第1天和第5天在梗死周围区高表达，到第28天逐渐降低[16]。但是S1PR5对AIS后BBB完整性的作用仍缺少直接的证据。

本研究用H2O2干预bEnd.3模拟AIS后BBB所处氧化应激环境，发现H2O2处理后S1PR5表达降低。给予S1PR5选择性激动剂A971432预处理可以逆转H2O2诱导FITC标记葡聚糖渗透增加的现象。通过蛋白免疫印迹实验进一步检测到激活S1PR5可以通过增加ZO-1、VE-Cadherin和Occludin的蛋白表达，增加内皮的连接功能和完整性，从而减少H2O2损伤造成的血管内皮高通透性。在AIS动物模型中，MMP-9高表达是导致血脑屏障破坏和出血转化的重要原因[17]。本实验中A971432也可显著降低H2O2处理后MMP-9的蛋白表达，从减少损伤的方面减少内皮屏障的破坏。

H2O2处理引起的过度损伤会导致细胞的凋亡发生[7,18]。在损伤刺激下，细胞凋亡可被内源性的线粒体途径和外源性的死亡受体途径激活。内源性途径中，Bcl2和Bax蛋白分别发挥着抗凋亡和促凋亡的作用来调节细胞的存活；而外源性途径中，当细胞内死亡诱导信号复合物形成后，将激活Caspase-8及下游的效应器Caspase-3和Caspase-7[19]。与先前研究一致[18]，我们的结果发现H2O2会打破Bax和Bcl2之间的平衡，增加Bax与Bcl2的比值，并显著增加凋亡的关键蛋白Caspase-3的表达。内皮细胞暴露于H2O2会激活细胞存活相关的复杂信号通路，Erk通路最常与细胞生长、存活和分化的调节相关，但不少研究表明Erk的激活在H2O2诱导的内皮细胞凋亡中发挥重要作用[7,18]，用Erk上游激酶 Mrk的特异性抑制剂U0126可以显著抑制H2O2诱导的大鼠脑微血管内皮细胞凋亡[18]。在本研究中，H2O2处理bEnd.3显著增加p-Erk1/2与Erk1/2蛋白的比值，与先前研究一致；而激动S1PR5可以显著降低凋亡相关蛋白表达以及p-Erk1/2与Erk1/2蛋白的比值，结合既往研究推测A971432激动S1PR5后减轻细胞凋亡可能与抑制Erk通路激活有关，而激动S1PR5是否通过其他机制抑制细胞凋亡并保护血管内皮通透性，后期将进一步研究。

氧化应激是AIS血脑屏障损伤及再灌注损伤级联反应的关键环节，过量的活性氧能诱导血管扩张并增加血管内皮细胞的通透性，进而加剧血脑屏障完整性和功能破坏。在本研究中，A971432预处理可以减少H2O2诱导的细胞内总活性氧，而且通过增加抗氧化分子Nrf2及其下游靶分子HO-1和下游抗氧化酶SOD1、SOD2的蛋白表达，来减轻H2O2造成的氧化应激损伤。

综上所述，本研究显示在H2O2损伤后，bEnd.3的S1PR5表达下调，A971432选择性激动S1PR5可以维持内皮屏障功能并减少细胞凋亡，这可能与抑制Erk通路有关，同时激动S1PR5可以通过上调Nrf2/HO-1信号通路来发挥抗氧化作用，但A971432总体的保护作用没有明显的浓度依赖性。结合S1PR5在急性氧化应激损伤中对血管内皮完整性的保护作用，我们推测S1PR5可以作为AIS血脑屏障损伤治疗的重要靶分子。后期将增加糖氧剥夺模型以及脑缺血再灌注动物模型的实验，来进一步探索S1PR5在AIS中的作用及分子机制，为AIS的临床治疗提供一定思路。