负载ZOL-GNPs的多孔钛合金支架促进OP骨缺损修复的作用机制

杨晓江，蒋明春，武振方，遆云帆，鲁经纬，赵建宁，孙国静

0 引 言

骨质疏松症(osteoporosis，OP)容易引发骨折甚至导致骨缺损的发生，由于其骨再生能力弱且新骨力学不稳，在临床治疗中面临巨大挑战[1-2]。尽管多孔钛合金支架是目前修复骨缺损最广泛的材料之一[3]，但由于其缺乏骨诱导和局部抗骨质疏松作用，限制了其在OP骨缺损修复中的应用。因此可以考虑将抗骨质疏松药物如唑来膦酸(Zoledronic Acid，ZOL)与支架相复合，从而达到局部给药促进OP骨缺损的修复。明胶纳米微球(gelatin nanoparticles，GNPs)药物递送体系具有密封性好，稳定性高，可控缓释等优点[4]，因此可以考虑将其作为中间桥梁，介导ZOL与支架的复合，从而达到局部缓释给药抗骨质疏松的效果。聚多巴胺(polydopamine，PDA)是一种常用的材料表面修饰物可以促进生物分子黏附[5]，可以提高包裹ZOL的GNPs在多孔钛合金支架上的负载效率。因此，本研究通过将“PDA涂层多孔钛合金支架”与“ZOL-GNPs”相结合，构建一种不但具有良好机械性能与生物相容性，而且还可以局部缓释给药抗骨质疏松的新型多孔钛合金支架，为OP骨缺损的临床治疗提供新思路、新方法。

1 材料与方法

1.1 负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架的制备根据文献报道的孔径及孔隙率[6]，利用Magics软件构建多孔钛合金支架三维模型(单胞结构：正十二面体单元，支架孔径：(520±35)μm，孔隙率：(57.0±4.2)%；然后基于电子束熔融技术(Electron Beam Melting，EBM)利用医用Ti-6Al-4V粉末进行PDA涂层多孔钛合金支架制备(圆柱支架：高度6 mm，直径5 mm)[7]。根据文献报道采用去溶剂化法制备GNPs，然后将GNPs浸入不同浓度的ZOL溶液中(1、10、50、100、500 μmol/L)制备ZOL-GNPs[8]。将PDA涂层多孔钛合金支架与不同浓度的ZOL-GNPs放入离心管于4 ℃冰箱摇床孵育12 h，再于-80 ℃冰箱预冷冻10 h后负压冻干，负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架制备完成，电镜观察其表面形态特征。对照组：不含ZOL的PDA涂层多孔钛合金支架(0μmol/L)；实验组：含不同浓度ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架(1、10、50、100、500 μmol/L)。

1.2负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架的载药释放检测将不同ZOL浓度的新型多孔钛合金支架与PBS在离心管中充分混合接触，固定于恒温摇床(37 ℃)；分别在第1、4、7、14、21和28天取出离心管，利用高效液相色谱仪(型号AH1260，Agilent，USA)及ZOL浓度标准曲线，计算出ZOL释药量及释药百分比。

1.3新型多孔钛合金支架浸提液条件下破骨细胞的骨吸收能力检测根据国家标准(医疗器械生物学评价：ISO 10993-5)，将支架经r射线照射消毒及PBS冲洗后与a-MEM培养基(10%胎牛血清、1%青-链霉素)按照0.2 g/mL比例混合孵育24 h，其上清液与无血清的а-MEM培养基混合稀释后加入10%胎牛血清无菌保存，新型多孔钛合金支架的浸提液配置完成。利用Osteo Assay Surface Plates (Corning, MA)进行骨吸收陷窝分析[9]。将BMMs (2×105cells)接种于微孔板中，6 h后将培养基替换为上述浸提液，并补充M-CSF(25 ng/mL)和RANKL(25 ng/mL)继续孵育，10 d后将破骨细胞用5%次氯酸钠溶液溶解；使用光学显微镜获得吸收陷窝图像，同时使用ImageJ software测量吸收陷窝面积。

1.4新型多孔钛合金支架浸提液条件下破骨细胞的凋亡检测不同浓度ZOL的复合支架浸提液与BMMs共培养7 d待破骨细胞成熟后，进行离心(以离心半径10 cm、1500 r/min,5 min)，弃上清液；使用PBS溶液洗涤细胞，再次离心(1500 r/min,5 min)，弃上清液，并使用PBS溶液配制10%的破骨细胞悬液。按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书进行Annexin V-FITC/PI双荧光染色，室温避光放置15 min后，加入300 μL的PBS重悬细胞，混合均匀后使用流式细胞仪检测；使用Cell Quest软件进行统计分析并绘制单色散点图(横坐标：FITC，纵坐标：PI)。

1.5新型多孔钛合金支架对OP骨缺损影响的动物体内研究

1.5.1 OP骨缺损模型构建选择新西兰系纯种大白兔36只(实验动物合格证号：SYDW20210344)，雌性，5月龄，体重(3.0±0.24)kg,饲养环境：温度，(22±1)℃；相对湿度：(50±1)%，明/暗周期：12/12 h。采用双侧卵巢切除去势法建立兔骨质疏松模型。在此基础上采用外科技术利用骨科电钻于股骨髁部，垂直骨干长轴且与冠状面平行，制备直径5 mm深度6 mm的圆柱形骨缺损；分别植入不同ZOL浓度的新型多孔钛合金支架。

1.5.2Micro-CT扫描术后8周和12周分别获取包含植入支架的单个骨块，选择支架周围直径5mm高6mm圆柱形区域为感兴趣区，通过Micro-CT进行扫描。使用容积重建软件进行三维重建，并使用GEHCV Micro-View 2.0软件进行骨生长定量分析，包括骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb. Th)、和骨小梁数目(Tb. N)。

1.5.3组织学检测Micro-CT扫描后的样品通过梯度乙醇溶液脱水后包埋于甲基丙烯酸甲酯中，使用硬组织切片机(Leica, Germany)进行切片(厚度：100 μm)。将切片固定于载玻片，并用改良的VG染色液进行染色。其中红色代表骨组织，蓝色为纤维软骨组织，黑色为钛合金支架材料。使用Leica LA自动显微镜(OLYMPUS, BX53, Japan)获取图像，对比分析支架周围骨长入情况。

1.5.4生物力学检测分别于支架植入术后8周和12周，安乐死兔子后获取包含植入支架及其周围组织的单个骨块，仔细刮除支架周围骨质及软组织，保留长入支架内部的骨质，同时在4%中性福尔马林固定液中固定24 h；然后将支架装载于MTS 858(Minneapolis，USA)生物力学测试机，沿支架长轴垂直压缩直至支架破坏后停止加载(加载速度：1 mm/min)。根据压缩载荷与形变位移绘制应力-应变曲线，并计算支架弹性模量(△应力/△应变)；同时按照同样方法测试新型支架植入动物体内前的弹性模量。

2 结 果

2.1 负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架的表征分析新型多孔钛合金支架制备完成后，经电镜扫描结果显示：ZOL-GNPs成球性好，表面光滑，均匀复合于支架的表面及孔隙内，球形规整无粘连，见图1。

图 1 负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架的表征分析

2.2负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架的载药释放检测结果显示：实验第1天释药量及释药百分比明显升高，在随后的27 d中，药物释放逐渐缓慢增加。10、50、100 μmol/L同一时间点释药量、释药百分比组组内两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。这表明该新型支架在体外至少保持数周稳定的ZOL释放速率。

表 1 负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架的载药释放检测

2.3新型多孔钛合金支架浸提液条件下破骨细胞的骨吸收能力检测结果显示：1 μmol/L ZOL组和10 μmol/L ZOL组骨板吸收面积[(28.22±4.17、33.41±3.23)mm2]明显高于对照组[(22.52±2.78)mm2]，差异有统计学意义(P<0.01)，而在50 μmol/L的组所形成骨板吸收面积明显低于10 μmol/L ZOL组(P<0.01)，且随着浓度升高，骨板吸收面积持续降低，见图2。

a:对照组; b-f：分别为1 、10 、50 、100 、500 μmol/L ZOL组

2.4新型多孔钛合金支架浸提液条件下破骨细胞的凋亡检测结果显示破骨细胞凋亡率随ZOL的浓度呈线性增加，所有实验组均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

a:对照组; b-f：分别为，1 、10 、50 、100 、500 μmol/L ZOL组

2.5新型多孔钛合金支架成功植入OP骨缺损模型成功构建了OP股骨髁骨缺损模型，并将不同支架植入模型中，术后X线片提示支架在位良好，见图4。

图 4 OP骨缺损模型的构建及新型多孔钛合金支架的植入

2.6新型多孔钛合金支架在OP骨缺损动物体内的Micro-CT扫描Micro-CT三维重建中黄色代表新长入的骨组织，白色代表多孔钛合金支架，对比显示：支架周围及内部均有不同程度的骨长入，50 μmol/L ZOL组的骨生长情况明显优于其他组，见图5。进一步定量分析发现：BV/TV、Tb. Th、和Tb. N在低浓度时随着ZOL浓度的升高而升高；当ZOL浓度为50 μmol/L时相关参数均为峰值(P<0.05)，随后均持续降低，见表2。

表 2 不同ZOL浓度新型多孔钛合金支架植入动物体内的骨生长参数

2.7新型多孔钛合金支架在OP骨缺损动物体内的组织学检测支架植入12周后进行组织学改良V-G染色显示支架内部可见明显骨长入，随着ZOL浓度的升高，新生骨量逐渐增多，当ZOL浓度为50 μmol/L时新骨量最大；随后随着ZOL浓度的升高，新生骨量逐渐减少，当ZOL浓度达到500 μmol/L时仅可发现少量骨再生,见图6。

a:对照组; b-f：分别为1 、10 、50 、100 、500 μmol/L ZOL组

2.8新型多孔钛合金支架在OP骨缺损动物体内的生物力学检测根据应力-应变曲线计算其弹性模量，对照组、100 μmol/L ZOL组和500 μmol/L ZOL组的8周[(1.86±0.08、1.95±0.15、1.89±0.16)GPa]和12周[(1.88±0.14)、1.87±0.12、1.91±0.17)GPa]支架弹性模量与支架植入前的[ (1.81±0.14)GPa]差异无统计学意义(P>0.05)；而1 μmol/L组、10 μmol/L组和50 μmol/L组的支架8周[ (2.11±0.11、2.26±0.13、2.58±0.09)GPa]和12周[ (2.23±0.07、2.48±0.16、2.91±0.10)GPa]弹性模量均显著高于支架植入前的弹性模量(P<0.05)，并且50 μmol/L组的支架弹性模量最高，接近人体松质骨弹性模量的同时，抗压性能较好。

3 讨 论

尽管多孔钛合金支架具有较好的生物相容性和良好的耐腐蚀性，已成为修复骨缺损最广泛的金属支架材料[10]。但OP骨缺损与一般骨缺损相比具有骨再生能力弱、新骨力学不稳、骨折再发率高等特点，普通多孔钛合金支架又缺乏骨诱导和抗骨质疏松作用，所以OP骨缺损修复后仍有较高风险出现骨折再发、延迟愈合、内植物松动塌陷等情况[1-2]。因此，我们基于GNPs的药物递送体系构建了一种负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架，该支架弹性模量接近人体松质骨，可避免应力遮挡影响，最重要的是该支架可保持数周稳定的ZOL释放速率。

ZOL作为最常用的双磷酸盐，是一种高效的静脉用氨基双膦酸盐，已经在全世界范围内被批准用于原发性或继发性骨质疏松患者[11-12]。但由于ZOL输注全身治疗时的不良反应导致患者的依从性较差[13]，因此在骨缺损局部进行缓释给药有可能避免这种全身使用所带来的副作用。本研究设计了不同浓度ZOL新型支架以分析ZOL-GNPs的释药效果，结果显示该新型支架可在体外至少保持数周稳定的释放速率(表1)，这表明该支架可作为局部药物递送的有效载体，这可能归因于GNPs的降解控制[14]。我们将鼠BMMs与不同ZOL浓度的新型多孔钛合金支架制备的浸提液共培养。通过对比Osteo Assay Surface Plate上形成的骨板吸收面积来量化评估骨吸收活性。1 μmol/L ZOL组和10 μmol/L ZOL组所形成的骨板吸收面积明显高于对照组，而在50 μmol/L的组所形成骨板吸收面积明显低于对照组(0 μmol/L)，且随着浓度的升高，骨板吸收面积持续降低(图2)。进一步使用双荧光标记法对破骨细胞进行浸提液条件下凋亡检测，结果量化对比分析显示破骨细胞凋亡率随ZOL的浓度呈线性增加(图3)。

双侧卵巢切除已经成为构建绝经后OP模型的经典方法[15]。兔和人类具有相似的骨密度和骨强度，因此兔子是最常用的骨缺损模型[16]，因此本研究在新西兰大白兔骨质疏松模型建立且验证成功的基础上，进一步采用外科手术构建OP股骨髁缺损模型，然后分别植入不同ZOL浓度的新型多孔钛合金支架，术后X线片显示支架位置良好(图4)。既往研究表明，骨质疏松性骨缺损处新生组织的质量和力学强度明显低于正常骨组织[17]，因此植入物的力学稳定性是骨质疏松性骨缺损部位修复的先决条件。本研究中，在支架植入8周和12周分别对不同ZOL浓度的植入支架进行进行垂直力学压缩实验，结果显示1 μmol/ L组、10 μmol/ L组和50 μmol/ L组的支架弹性模量均显著高于支架植入前的弹性模量(P<0.05)，并且50 μmol/L组的支架弹性模量最高，接近人体松质骨弹性模量的同时，抗压性能较好(表3)。通过Micro-CT对骨生长情况进行定量分析发现：无论是在8周还是12周，在BV/TV、Tb. Th、和Tb. N的对比分析中，在低浓度ZOL中呈现浓度依赖正相关，随着ZOL浓度的升高而升高；当ZOL浓度为50 μmol/L时相关参数均为峰值(表2，图5)。组织学染色结果也显示随着ZOL浓度的升高，新生骨量逐渐增多，当ZOL浓度为50 μmol/ L时新骨量最大(图6)。

本研究具有一定的局限性。各实验组之间的ZOL浓度差别较大，对于ZOL-GNPs药物递送体系中的最佳载药浓度值得进一步研究；该新型支架对于其他类型骨质疏松症(比如：老年男性骨质疏松症、继发性骨质疏松症和特发性骨质疏松症)是否有效，还需要进一步研究证明。

综上所述，本研究成功构建了一种负载ZOL-GNPs的PDA涂层多孔钛合金支架，该支架可保持数周稳定的ZOL释放速率，具有局部药物缓释抗骨质疏松作用，促进新生骨组织与支架之间的良好骨整合，为OP骨缺损的治疗提供新思路和新方法。