CBX2在鼻咽癌的表达及其对鼻咽癌细胞生物学行为的影响

蔡义侠, 闫杰成, 江丹贤, 吴伟豪, 黄 静

0 引 言

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国常见的头颈恶性肿瘤，以华南地区最为高发，严重威胁人民的生命健康[1]。目前临床上鼻咽癌的早期诊断及治疗主要依靠爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein-Barr virus, EBV)检测、内镜及影像检查[2-3]。研究认为，EB病毒感染与鼻咽癌发病密切相关[4]，约90%以上鼻咽癌患者活检组织及血清中能找到EB病毒核酸、病毒抗原或抗体。然而临床上时常观察到不少初治或治疗后复发转移的鼻咽癌患者，EB病毒抗体及DNA检测呈阴性[5]。现有的检验检测指标，并不能完全满足临床诊治的需要。寻找有效的分子生物标志物用以指导鼻咽癌患者的诊治依然是广大临床科研工作者努力探索的问题。

色素框同源蛋白CBX是多梳蛋白家族的一个重要成员，与细胞的分化、胚胎发育和肿瘤发生密切相关[6-11]。CBX2是CBX家族成员之一，本课题组前期研究通过ceRNA芯片分析发现CBX2在鼻咽癌组织中表达显著高于正常对照鼻咽组织。既往文献报道，CBX2在多种肿瘤中异常表达，广泛参与肿瘤细胞的增殖、转移和凋亡等恶性生物学行[12-14]。但是CXB2是否与鼻咽癌发病相关，并且影响鼻咽癌细胞的生物表型尚未明确。因此，本研究旨在进一步明确CBX2在鼻咽癌组织及细胞系的表达情况，并分析其对鼻咽癌细胞系SUNE1增殖、迁移与侵袭的作用，期待为鼻咽癌的发病及诊治提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本与细胞随机选取2018年1月至2019年1月在广东医科大学附属医院进行活检的(41份)鼻咽癌组织和(35份)鼻咽慢性黏膜炎组织标本。新鲜标本离体后装入冻存管置于液氮中保存。所有标本经病理学确诊。人鼻咽癌细胞系(CNE1、CNE2、SUNE1、5-8F)及人正常鼻咽上皮细胞系NP69来源于中南大学细胞室。所有鼻咽癌细胞系均用含有10%胎牛血清的1640培养基，NP69细胞系用K-SFM无血清培养基培养(购自Gibco公司)，所有培养基均加入1%青霉素/链霉素。本研究经医院医学伦理委员会审核批准(审批号：PJ2019-010)，所有标本对应被采集者均签署知情同意书。

1.2siRNA和瞬时转染设计并合成CBX2-target的小干扰RNA(苏州吉玛)序列如下：siNC：正义链，5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3′；反义链，5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。CBX2-siRNA#1：正义链，5′-GGAUGACAGUGACUUAGAUTT-3′；反义链，5′-AUCUAAGUCACUGUCAUCCTT-3′。 CBX2-siRNA#2：正义链，5′- CCAGAUCCUGGUGGCCAAATT -3′；反义链，5′- UUUGGCCACCAGGAUCU GGTT-3′。取对数生长期的SUNE1细胞，胰酶消化制成细胞悬液，调整细胞密度至1×105个/mL接种在6孔板中，于37 ℃，5% CO2培养箱中继续培养，待细胞长至30%的融合度时使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(ThermoFisher Cat No.13778030)用7.5 nmol/L siRNA进行转染。孵育48～72 h后收取RNA和蛋白分别检验siRNA的敲低效率。

1.3RNA提取和RT-PCR检测采用Trizol试剂进行细胞总RNA提取，分光光度仪测定总RNA浓度，经逆转录反应合成 cDNA，以GAPDH作为内参，ABI7500荧光定量PCR仪上TB Green法检测CBX2 mRNA表达情况。

1.4细胞增殖检测(CCK-8法)转染48 h后，胰酶消化各组细胞，制成细胞悬液，按3×104个/mL的密度接种于96孔板中(100 μL/孔)，培养箱中孵育4～6 h。待细胞贴壁后每孔加入10 μL CCK-8检测试剂，置于培养箱中避光孵育2 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，采集各孔的A值。

1.5克隆形成实验将各组细胞按500个/孔接种到6孔板中。于37 ℃，5% CO2培养箱中继续培养7～10 d，出现肉眼可见的细胞克隆(>50个细胞的集落)时，终止培养，用20%甲醇固定，0.1%结晶紫染色，计数并计算克隆形成率。

1.6细胞周期检测处于生长期的各组细胞经胰酶消化，调整细胞密度，加入预冷的75%乙醇(终浓度为70%)，轻轻吹打混匀，4 ℃固定过夜。离心并收集固定后的细胞,加100 μL RNase A并充分悬浮细胞，然后于37 ℃温箱孵育30 min,再加入400 μL PI并充分混匀，4 ℃避光30 min，上机检测，记录激发光波长488 nm处红光，检测细胞所在周期。

1.7细胞迁移和侵袭实验(Transwell法)在siRNA转染后48 h后胰酶消化各组细胞，制成细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/mL。对于迁移试验，将5×104个细胞(100 μL，含1%FBS的1640培养基)接种到上室。对于侵袭试验，上室用250 g/mL基质凝胶(康宁)预包被，然后在37 ℃孵育1 h，随后将5×104个细胞接种于上室中。为了诱导细胞迁移，所有下室均填充有含有20% FBS的1640培养基500 μL。细胞培养24 h后，用棉签擦拭残留在上室膜上的细胞。然后将穿过膜的细胞用20%甲醇固定并用0.1%结晶紫染色。使用EVOS倒置显微镜对每个小室的5个随机场进行拍照，用Image J软件计数并进行统计。

1.8Western blot检测转染72 h后收集细胞，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，提取细胞总蛋白，用BCA 法定量，以10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，用10% 脱脂奶粉封闭，依次孵育一抗、二抗后，通过化学发光成像系统(Tanon 5200，中国上海)检测。β-actin、β-catenin, cyclin D1和CBX2以1:1000稀释度使用。二级抗体(山羊兔抗/辣根过氧化物酶)以1:5000稀释度使用。

2 结 果

2.1 CBX2在鼻咽癌组织和细胞系中高表达RT-PCR分析结果显示，鼻咽癌组织中 CBX2 mRNA表达水平显著高于鼻咽慢性炎性组织(P<0.01)，这进一步验证了我们前期芯片检测的结果。同时，我们也验证了CBX2 mRNA在几株常见鼻咽癌细胞系中的表达水平，RT-PCR结果表明CBX2在鼻咽癌细胞中的表达水平明显高于正常鼻咽上皮细胞系NP69。见图1。

a：组织水平；b：细胞水平

2.2敲低CBX2的表达抑制了鼻咽癌细胞的增殖和克隆形成能力RT-PCR检测结果表明，转染48 h后，与siNC(0.59±0.06)相比，转染CBX2-siRNA#1(0.19±0.11)和#2(0.27±0.06)两组SUNE1细胞的CBX2 mRNA表达量显著降低(P<0.01)。CCK-8实验结果显示，转染CBX2-siRNA 48h后，SUNE1细胞的增殖速率相比siNC组开始显著下降，其中siRNA#1转染组下降最为显著(P<0.01)，见图2。平板克隆形成实验结果亦表明，与siNC(54.33±4.51)相比，转染CBX2-siRNA#1(28.33±4.16)和#2(34.67±3.79)后两组SUNE1细胞的克隆形成能力显著降低(P<0.01)，见图3。上述结果表明敲低CBX2表达对SUNE1细胞的生长及增殖能力具有抑制作用。

与siNC比较，*P<0.01

a：siNC，b: siRNA#1，c: siRNA#2

2.3敲低CBX2表达降低鼻咽癌细胞的体外迁移和侵袭能力Transwell实验结果显示，与siNC相比，CBX2-siRNA#1和#2的迁移和侵袭细胞数目均显著减少(P<0.01 )，见图4，表1。

图 4 敲低CBX2后SUNE1细胞的迁移和侵袭能力变化比较

表 1 迁移和侵袭细胞数的变化

2.4siRNA转染后鼻咽癌细胞SUNE1的细胞周期变化流式细胞检测结果显示，敲低CBX2表达后，SUNE1细胞的周期发生了改变。相比较于siNC组，转染siRNA#1后，S期的SUNE1细胞细胞比例显著增多，G2/M期的细胞比例显著降低，细胞发生了S期阻滞。转染siRNA#2后，则G0/G1期细胞增多，S期细胞显著降低，细胞发生 G0/G1期阻滞(P< 0.01)，见图5。

a：流式检测细胞周期；b：细胞周期统计图

2.5Western blot法检测转染siRNA后SUNE1细胞中蛋白的相对表达水平Western blot结果显示，与siNC相比，siRNA#1和siRNA#2的鼻咽癌细胞中LRP6、β-catenin、cyclinD1的蛋白表达水平降低(P< 0.01)，见图6。

a：蛋白表达条带 ；b：蛋白表达量统计图

3 讨 论

鼻咽癌是一种多基因参与、遗传与环境因素协同作用的恶性肿瘤，具有明显的地域和族群聚集分布特征[15]。尽管其对现有放化疗等治疗手段相对敏感，由于首诊中晚期患者居多，治疗后易出现局部复发和远处转移，总体疗效依然不尽如人意[16-17]。科学家们一直致力于探索鼻咽癌的发病机制[18]，寻找鼻咽癌发生发展相关的分子标志物，用于高危人群筛选、发病预测和早期诊断，从而降低该疾病的危害。

基于PcG蛋白在表观遗传调控中发挥的重要作用，近年来对于CBX蛋白的结构和功能研究愈发广泛[19-20]。CBX2蛋白包含了完整的CD、Pc、AT Hook和ATHL结构域，能通过识别和结合H3K27me3募集PRC1，参与PRC1复合体的组装机转录抑制功能的发挥[21-22]。研究发现机体内CBX2表达紊乱与多种肿瘤的发生发展密切相关。例如，在白血病细胞中，CBX2的异常缺失直接导致U937细胞形态的改变，并且削弱了其增殖能力[23]。在骨肉瘤组织中CBX2表达显著上调，CBX2高表达与骨肉瘤患者的转移复发、差的化疗疗效相关，是不良预后的影响因素[24]。在卵巢癌中的研究发现CBX2作为miR-342-5p的靶向基因抑制卵巢癌细胞的生长、转移并促进凋亡，发挥致癌基因的作用[25],而且它被确定为高等级浆液性卵巢癌的逃逸和驱动因素[26]。高表达CBX2的肝癌的生存率明显降低[27]。CBX2的表达可预测食道鳞状细胞癌治愈性切除术后的预后情况[28]。功能研究发现，CBX2可能通过Wnt/β-catenin或YAP/β-catenin通路从而调控肿瘤细胞的增殖[13, 26]。然而，CBX2在鼻咽癌中的表达模式、功能及其调控机制目前尚不明确。

本研究在前期芯片分析的基础上，利用实时定量PCR检测了鼻咽癌组织和细胞株中CBX2的表达情况，结果表明CBX2在鼻咽癌组织和细胞中的表达量显著高于其正常对照，提示CBX2的异常表达可能与鼻咽癌的发生发展相关。为进一步探索CBX2是否影响鼻咽癌的恶性生物学行为，我们利用CBX2 siRNA转染SUNE1细胞株，并进行了CCK8、克隆形成实验、细胞周期、迁移及侵袭实验。实验结果显示，敲低CBX2表达显著抑制鼻咽癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。细胞周期结果表明，转染不同siRNA片段后，CBX2可能发生了不同的转录抑制，导致siRNA#1组和#2组的细胞周期分别受阻于G0/G1期和S期。对其机制进行初步探索，WB检测结果显示，CBX2蛋白表达水平的下调可能直接导致影响β-catenin表达，进而抑制其下游周期相关蛋白CyclinD1及LRP6的表达。敲低CBX2可能通过Wnt/β-catenin途径抑制鼻咽癌细胞的恶性生物学行为。

综上所述，鼻咽癌中CBX2的表达水平升高，且CBX2高表达能促进鼻咽癌细胞增殖和转移，其可能是CBX2通过调节Wnt/β-catenin途径来实现的。提示CBX2对鼻咽癌的发生发展发挥重要作用，然而其是否可作为鼻咽癌不良预后的预测指标及临床潜在诊治靶点仍有待进一步研究。