博来霉素诱导肺纤维化小鼠肺组织差异转录因子的筛选与功能分析

沈忱悠，李桂荣，卫 栋，聂晓伟，杨旭生，王 伟，江 成，盛雅婷，邹 建，赵晶晶，陈静瑜

0 引 言

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性、进展性、与年龄相关且起因不明的间质性肺疾病，确诊后若不采取治疗措施，患者的平均存活时间仅为3～5年[1-2]。现有指南推荐的IPF治疗药物为吡非尼酮与尼达尼布[3-4]，但这两种药在阻止病情发展和提高患者生活质量方面的效果均有限，且存在耐药情况[5-6]。肺移植是目前公认的治愈IPF的唯一方案，但考虑到年龄、并发症等实际问题，此治疗方案仅适用于少数IPF患者[7]。IPF的发病机制尚未阐明，近年来被普遍接受的病因机制包括有遗传倾向的肺泡上皮反复的亚临床损伤及后续其再生与修复的失败[8-9]。肺泡内的活性细胞分泌过剩的细胞因子与生长因子，从而促进肺成纤维细胞的募集、增殖及分化，导致过量胶原堆积、肺实质的进展性瘢痕性改变，最终造成肺功能的不可逆损失[10-11]。目前研究IPF疾病的体内模型中，气道给予博来霉素法因其相对廉价的造模成本、博来霉素诱导后产生的强烈纤维化反应以及造模动物与IPF患者相似的病理学特征而被广泛应用[12]。

转录因子是一类在特定的空间与时间中协调基因表达的蛋白，其在各类生物进程中扮演基因组控制台的角色，精细调控着基因转录，最终通过诱导或维持细胞命运，参与塑造生物有机体的表型[13]。转录因子的活性受其分子生物学特性影响，即便处在不同的调节网络，多个转录因子也可同步参与诱导蛋白分子间的相互作用[14]。转录因子内部无序的结构特征使其相互作用具有一定的可互换性；转录因子的蛋白质间相互作用及其对DNA结合基序的亲和性决定了其对靶基因的选择性和染色体结合动力学[14-15]。

已有的病因学研究发现，包括TERT、SFTPA2、MUC5B等众多基因的异常表达与IPF的发病有关[16-17]，但这其中有关转录因子在IPF发生中表达与作用的报道则较为罕见。本研究拟对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中差异表达的转录因子进行筛选及分析，从基因转录调控的角度探讨肺纤维化的发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料博来霉素(日本化药株式会社)，Bouin固定液(北京百奥莱博)，Masson染色试剂盒(南京建成)，Trizol(美国sigma)，逆转录试剂盒、mRNA qPCR mix荧光定量试剂盒、小鼠转录因子PCR Array Plate检测试剂盒(上海沃吉基因)；石蜡包埋机(常州派斯杰)，切片机(德国徕卡)，光学显微镜(日本奥林巴斯)，核酸凝胶电泳系统(上海天能)，紫外/可见分光光度计(美国NanoDrop)，实时荧光定量PCR仪(美国ABI)。

1.2动物与分组雄性SPF级C57BL/6小鼠14只，鼠龄6周，体重(25±2)g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许证号：SCXK(苏)2016-0010。通过完全随机化分组法按1∶1比例将小鼠-分为博来霉素组与对照组，每组7只。博来霉素组按5 mg/kg体重剂量采用移液器鼻腔滴入方式给予博来霉素，对照组给予等剂量等渗盐水。造模前后两组小鼠均常规饲养，自由摄食。造模3周后，安乐处死全部小鼠，低温无菌条件下取出肺组织。根据解剖学特征将肺组织分为5叶，每只小鼠取一叶用于Masson染色，以评估模型构建是否成功；余下4叶存放于超低温冰箱，用于后续差异表达基因的筛选与分析。

1.3方法

1.3.1 Masson染色将新鲜取下的小鼠肺组织浸泡入Bouin固定液中，室温固定12 h。75%乙醇洗涤脱去黄色后，进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。使用切片机将包埋好的组织蜡块切片后，按Masson染色试剂盒说明书进行染色。中性树胶封固后于显微镜下观察，细胞质与肌纤维被染成红色，胶原纤维则呈蓝色。

1.3.2小鼠转录因子PCR Array检测通过简单随机抽样法-每组各抽取3只小鼠，提取其肺组织总RNA。通过RNA核酸电泳检测所提取RNA的完整性，使用紫外/可见分光光度计测定其浓度与纯度；RNA质检合格后按照逆转录试剂盒说明合成cDNA。根据小鼠转录因子PCR Array试剂盒说明对cDNA样品进行荧光定量PCR检测，以测定各组样品的循环指数(即Ct值)。

1.3.3生物信息学分析通过转录因子-靶基因在线数据库TRRUST(https://www.grnpedia.org/trrust)对PCR Array筛选出的高表达与低表达转录因子分别进行靶基因预测。为降低假阳性率，本研究取TRRUST数据库与Harmonizome数据库(https://maayanlab.cloud/Harmonizome)预测所得的交集基因作为最终靶基因；其中Harmonizome数据库共包括CHEA Transcription Factor Targets Dataset、ENCODE Transcription Factor Targets Dataset、JASPAR Predicted Transcription Factor Targets Dataset、MotifMap Predicted Transcription Factor Targets Dataset、TRANSFAC Curated Transcription Factor Targets Dataset与TRANSFAC Predicted Transcription Factor Targets Dataset等6个转录因子靶基因数据集，本研究将至少由其中2个数据集共同预测所得的靶基因作为Harmonizome数据库的预测结果。使用在线生物信息数据库DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)对预测所得的靶基因进行基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路预测，其中GO分析包括生物进程、细胞组分以及分子功能。

1.4统计学分析生物信息学分析以小鼠转录因子PCR Array检测结果为基础，采用2-ΔCt法计算相对表达倍数、t检验法计算P值，选取表达倍数变化值≥2且P值<0.05的基因作为差异基因。使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。

2 结 果

2.1 小鼠肺纤维化模型建立Masson染色结果显示：对照组肺组织绝大部分区域呈红色或淡红色，仅部分血管周围被染成蓝色，且着色较浅，提示肺组织无明显异常；博来霉素组的蓝染区域则明显增加，且着色加深，提示肺组织胶原纤维堆积，肺纤维化模型构建成功。见图1。

a.对照组；b.博来霉素组

2.2小鼠肺组织转录因子表达谱以Fold Change≥2、P<0.05作为筛选条件对两组小鼠肺组织PCR Array结果进行分析，可见在本次Array检测的90个基因中，红框标出的6个基因在博来霉素组与对照组中各自积聚到一个集中区域，见图2。与聚类图一致，火山图结果显示在转录因子表达谱中，与对照组相比，博来霉素处理组中共有6个差异表达的转录因子，其中上调者1个，为EGR1；下调者5个，分别为AR，ESR1，FOXG1，HAND2，HSF1，见图3。提示上述差异表达的转录因子可能参与肺纤维化的发生。

1-3：对照组； 4-6：博来霉素组

图 3 转录因子火山图

2.3差异转录因子的靶基因预测通过TRRUST在线数据库对差异表达的转录因子进行靶基因预测，得到上调靶基因71个，下调靶基因55个。见表1。使用Harmonizome数据库进行验证，得到至少由其2个数据集共同预测所得的上调靶基因4768个，下调靶基因2267个。见图4。对TRRUST与Harmonizome预测结果取交集，最终获得差异转录因子的靶基因共43个，其中上调靶基因27个，下调靶基因16个。

表 1 差异表达转录因子的靶基因预测

a：差异上调；b：差异下调

2.4GO富集分析通过DAVID数据库对差异表达转录因子预测所得的靶基因进行GO富集分析。结果显示，上调转录因子的靶基因在生物进程方面主要参与对细胞增殖的负调控、凋亡、衰老等过程，在细胞组分方面主要涉及细胞质、细胞核、细胞溶质等组分，在分子功能方面与蛋白结合、大分子复合物的结合、整合素结合等功能相关；下调转录因子的靶基因在生物进程方面主要参与以DNA为模板的转录调控、RNA聚合酶II启动子相关的转录正向调控、对神经元分化的正向调控等过程，在细胞组分方面主要涉及细胞核、细胞质、核质等组分，在分子功能方面与蛋白结合、DNA结合、序列特异性DNA结合的转录因子活性等功能相关。见图5。

a：差异上调；b：差异下调

2.5KEGG信号通路分析通过DAVID数据库对差异转录因子的靶基因进行KEGG信号通路分析。结果显示，上调转录因子的靶基因富集于58条信号通路中，主要参与肿瘤相关通路、MAPK通路、PI3K-AKT通路、FoxO通路、卡博氏肉瘤病毒感染等过程；下调转录因子的靶基因富集于50条信号通路中，主要参与HIF-1通路、肿瘤相关microRNAs通路、糖尿病并发症相关的AGE-RAGE通路、麻疹、化学致癌受体激活等过程。见图6。

a：差异上调；b：差异下调

3 讨 论

IPF因其不可逆的病程与特定的治疗手段，被认为是一类特殊的间质性肺疾病。未接受肺移植的IPF患者在确诊后的中位生存期仅为3～5年，其预后较多数肿瘤差，被称为不是癌症的癌症[18]。全球范围内，IPF的发病率约为每10万人50例，且发病率随着年龄的增长而增加，大部分患者确诊时已超过50岁[19]。随着世界老龄化社会的到来，IPF势必会给患者的身体、心理以及社会经济造成巨大负担[20]。IPF的发病机制尚未阐明，其错综复杂的发病机理与肺泡上皮修复失调、宿主防御、细胞衰老、免疫应答异常、成纤维细胞增殖相关激酶活性改变等众多因素相关[21]。

在协同调控IPF发生发展的多种因素中，转录因子作为一类从时间、空间上精确调控基因转录的生物分子，它们通过与启动子结合来调控相应基因的表达，在IPF的发病进程中起着重要作用。例如，核转录因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)与其下游的NOD样受体家族热蛋白结构域3(NOD-likereceptorfamilypyrin domaincontaining3，NLRP3)炎症小体组成的NF-κB/NLRP3通路通过调控炎症反应及上皮间质转化等过程参与了肺纤维化的发生[22-23]；在转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)诱导的肺纤维化细胞模型中，被MAPK通路元件激活的活化剂蛋白1(activator protein 1，AP-1)参与了对人肺成纤维细胞向肺纤维化的效应细胞肌成纤维细胞转化的调控[24]；NF-κB与AP-1亦可通过调控C-C基序趋化因子配体2的表达来参与TGF-β介导的细胞外基质形成[25]；另外，Smad家族的Smad2、Smad3及Smad7均在IPF的发生发展中起着重要的调控作用[26]。

近年来，随着高通量基因芯片与测序技术的不断发展，越来越多的科研工作者将该类技术应用于包括IPF在内各种疾病的研究。在多数芯片或测序分析中，由于转录因子的表达变化程度在差异基因中常无法排至前列，其重要性容易被忽略；而通过预测靶向调控差异基因的转录因子等方法，虽可在一定程度上挖掘IPF的潜在调节分子，但受预测软件种类、筛选条件设定等因素影响，结果往往会出现不统一或假阳性。基于此，为进一步系统地研究转录因子在IPF发生过程中的作用，我们对正常组与IPF模型组小鼠的肺组织进行了转录因子PCR Array检测。在本次Array检测的90个基因中，我们发现与对照组相比，博来霉素组中差异表达的转录因子共6个，其中上调基因1个，为EGR1；下调基因5个，为AR，ESR1，FOXG1，HAND2，HSF1。

早期生长反应蛋白1(early growth response1，EGR1)作为可诱导的锌指家族转录因子之一，参与调控包括炎症、基质形成、凋亡等在内的多项生物进程。Chu等发现在二氧化硅诱导的人肺上皮细胞中，EGR1可被上游的MAPK通路激活[27]；Ghatak等[28]亦在TGF-β诱导的小鼠肺成纤维细胞中发现了活化的ERK-EGR1通路。在本研究博来霉素诱导的小鼠模型中，EGR1表达上调的结果与上述体外实验的文献报道一致，提示EGR1可能在IPF的发生中起着重要的调控作用。雄激素受体(androgen receptor，AR)是一种具有配体活性的转录因子，属于类固醇激素受体家族。AR介导雄性激素在男性性发育过程中起关键作用，并具有维持体内激素平衡、刺激蛋白质合成代谢等生理功能。肺部疾病相关研究发现，AR突变与野生雄性小鼠建立的哮喘模型中，AR突变型较野生型具有更强烈的气道炎症反应，提示AR可能对哮喘的炎症过程具有保护作用[29]；Leach等[30]报道，AR通过调控其靶基因TMPRSS2参与冠状病毒感染宿主细胞的过程，抗AR配体药物可有效降低SARS冠状病毒对人肺上皮细胞的感染率，该发现为临床防治新型冠状病毒肺炎提供了潜在用药靶点；Mehrad等[31]在对IPF患者肺组织进行的免疫组化检测中发现AR染色呈阴性，这与本研究AR在小鼠IPF模型中表达下降的结果并不矛盾，因免疫组化结果无法精确定量，故AR在IPF中的表达变化及其中机制仍待进一步验证与探究。与AR相似，雌激素受体1(estrogen receptor 1，ESR1)也是一种配体激活的转录因子，后者通过调控可被雌激素诱导基因的转录，参与了生长、代谢、性发育、妊娠等生理过程，在非生殖系统组织中亦有表达。在ESR1与IPF相关的研究中，Smith等通过建立肺纤维化体外与体内模型，均发现ESR1表达量的降低，而介导ESR1表达变化的上游基因即为经典促纤维化因子TGF-β[32-33]；Elliot等[34]则在IPF患者肺组织中发现ESR1表达上调，且该现象与microRNA let-7的调控作用有关。由于细胞与动物层面的实验毕竟无法真实模拟人体疾病进程，且转录因子及疾病相关基因的表达存在时间、空间特异性，故ESR1在IPF中的表达变化及其中机制仍待进一步研究。热休克转录因子(heat shock transcription factor 1，HSF1)是一种在温度上升等应激状态下可被迅速诱导并表达的转录因子，HSF1通过与热休克蛋白结合行使其在生长发育、细胞凋亡等方面的调节功能。Chen等[35]发现，HSF1可能通过YY1/HSF1/miR-214/THY1作用轴参与了IPF的发生。本研究中筛选得到的另外两个差异转录因子叉头蛋白G1(forkhead box G1，FOXG1)以及心脏与神经嵴衍生物表达蛋白2分别在神经发育与心脏形态发生中起着重要调控作用，然而两者与IPF的关系尚鲜有报道，提示其在IPF中的作用值得进一步研究。

转录因子是调控基因表达的重要分子，我们通过数据库对本研究中差异表达转录因子的靶基因进行预测，结果显示，上调与下调转录因子的靶基因数量分别为27和16个。为进一步探索上述差异转录因子功能，我们对相应靶基因进行了GO注释与KEGG通路富集分析，其结果可为后续转录因子在IPF中作用机制的研究提供一定的参考。功能注释与通路预测结果显示，上调转录因子主要与调控细胞凋亡进程、细胞质、蛋白结合等功能有关，主要通过MAPK、PI3K-AKT、FoxO等信号通路参与肺纤维化的发生；下调转录因子主要与以DNA为模板的转录调控、细胞质、DNA结合等功能有关，主要通过HIF-1、p53、Apelin等信号通路参与肺纤维化的病理生理进程。其中MAPK(6个靶基因)、PI3K-AKT(5个靶基因)、HIF-1(3个靶基因)等信号通路目前已被广泛报道参与IPF的发病进程[36-37]。

综上所述，本研究使用PCR Array检测博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中转录因子的表达情况，通过筛选得到6个差异因子(1个上调转录因子：EGR1；5个下调转录因子：AR，ESR1，FOXG1，HAND2和HSF1)，运用生物信息学方法预测了相应的靶基因，对后者进行功能注释和通路富集分析，并结合现有研究报道初步探讨了差异转录因子在IPF发病过程中可能起到的作用。下一步，我们将通过实时定量PCR、蛋白免疫印迹等技术验证差异转录因子在肺纤维化小鼠模型以及IPF患者肺组织与血清中的表达变化，并在IPF体外与体内模型中对其进行功能学研究。我们的研究结果可为IPF的临床防治与早期诊断提供潜在的用药靶点与分子标志物。