慢性肾脏病兔心肌跨壁复极离散及膜离子流变化的实验研究

余 平 李 晴

武汉市第三医院/武汉大学附属同仁医院1急诊科，2心肺功能科 湖北 武汉 430060

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）在我国发病患病均高，已经成为一个重要的公共卫生问题，我国CKD 患者总患病率接近10%［1］。随着病程进展，CKD 患者会最终进展为终末期肾脏病，并常并发心血管疾病［2，3］。心、肾作为控制机体有效循环和血流动力学稳定的两个重要器官，生理和病理状态均存在相互依存现象［4］。心肌损害会大幅增加死亡等不良预后的发生概率，比如心室肥厚缺血会引发心律失常进而增加心源性猝死的风险。统计结果提示，在我国各种原因导致的左心室肥厚、心力衰竭发生率近年来一直呈现升高趋势；对于CKD 患者人群，早期评估心血管病变以及进行疗效判断提供更简便、低创伤性的检查以及辅助检测方法愈发受到关注［5，6］。其中，心肌细胞电生理相关指标可以为表征心肌及心血管病变提供便捷无创的测量信息，相关研究则始于20 世纪50年代末。目前我们已经明确急性心肌缺血以及左室肥厚等病理状态下，可见跨壁复极离散度（TDR）增加［7］。心电图Tp⁃Te 间期可以反映心室肌跨室壁复极离散度，而Tp⁃Te/QT 比值是校正后的Tp⁃Te 间期，排除心率影响后，这些指标可以较为真实地反映TDR 状态［8］。希望基于此类指标检测，可以为临床医师在CKD 心血管病变病程评估、疗效判断方面提供一种更为简便、可行、无创的辅助检查方法。

1 对象与方法

1.1 构建兔慢性肾衰竭模型对照组（5 只）：将食用油以10 mL/（kg·d）给实验动物定时、定量灌胃，全程正常饲养；每周内眦静脉采血1 mL 检测血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血清肌酐（serum cre⁃atinine，Scr）及C⁃反应蛋白（C⁃reactive protein，CRP）；至第6 周造模结束时，行心脏超声检测。CKD 组（5 只）：将3%腺嘌呤食用油溶液以10 mL/（kg·d）给大鼠定时、定量灌胃，1 次/d，共6 周；每周内眦静脉采血1 mL 检测BUN、Scr 及CRP，至第6周造模结束，余饲养同对照组；心脏超声检测、HM/BM 和LVM/BM、心肌组织学形态检测同对照组。以Scr 水平进行评估，Scr 水平均升高2～3 倍提示造模达标。

1.2 观察指标及测量首先进行实验动物心室肌细胞的分离与复钙：制备膜片钳的金属电极为银丝（镀氯化银），玻璃电极由硼酸盐硬质玻璃毛细管拉直而成（使用拉制仪多次拉制玻璃毛细管）；形成常规全细胞记录模式，膜片钳实验由计算机、Clampex软件、数据采集卡和膜片钳放大器组成。完成电极尖端与细胞膜之间的巨阻抗封接，形成全细胞记录状态。随后进行电生理学测定等。最后进行数据分析。

1.2.1 不同时期、不同部位心肌病理观察 HE 染色后使用光镜观察心肌细胞形态及病理改变。

1.2.2 心电图测定 走纸速度为25 mm/s，电压定标：1 mV/cm，测量胸前各导联的Tp⁃Te 间期取平均 值，测 定 胸 前 导 联Tp⁃Te 离 散 度（Tp⁃Ted）。Tp⁃Te 间期为T 波顶点至T 波终点。Tp⁃Te 离散度为胸导联最大Tp⁃Te 间期与最小间期之差。

1.2.3 借助单相动作电位记录技术分析心肌单相动作电位 研究中将心室楔形肌块以细针固定于灌注槽底硅胶板上行主动脉逆行灌注，恒温恒速下进行灌注（37 ℃，5 mL/min），30 min 内测定和对比心肌细胞的静息膜电位（RMP）、最大动作电位幅度（APA）和动作电位复极90%时程（APD90）。

1.2.4 使用膜片钳技术观察电解质干预下膜离子流变化 分析钾离子和镁离子对膜离子流的影响。

1.3 统计学分析使用pClamp8.0 软件进行信号采集，Clampfit 8.0 进行数据和图形分析处理。计数和计量资料资料检验分布特征后，使用对应统计学检验方法完成组间对比的统计学检验，统计学检验使用SPSS 软件完成。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学特征及病理改变的观察HE 染色后观察心肌病理特征：光镜下可见对照组心肌纤维整体排列清晰整齐；心肌细胞呈短柱状，结构完整，染色较均匀，心肌纤维纹理清晰，排列整齐，粗、细心肌纤维相间。CKD 组心肌纤维排列尚清晰；心肌细胞分布弥散，结构尚完整，染色欠均匀，细胞核可见破碎、溶解，核两端肌浆分散，并可见周围心肌细胞与之相溶，心肌纤维呈波浪状且排列紊乱，局部肌纤维可见空泡变性以及出血。详见图1 所示。

图1 两组实验动物心肌病理改变特征

2.2 T 波 振幅、Tp⁃Te、Tp⁃Ted 与CKD 病期的关系CKD 组T 波振幅总水平低于对照组水平；CKD组Tp⁃Te 以及Tp⁃Ted 总水平均高于对照组（均为P<0.05）。CKD 组内 不同病期对比，1～4 期T 波振幅高于5 期水平，Tp⁃Te 以及Tp⁃Ted 均低于5 期水平（均P<0.05）。详见表1 所示。

表1 波振幅、Tp⁃Te、Tp⁃Ted 与CKD 病期的关系特征分析

此外，对心肌细胞RMP、APA 和APD90分布及变化进行分析，可见不同心肌细胞RMP、APA 和APD90基础值差别未见统计学意义，如表2 所示。随着时间点变化，CKD 组及对照的外膜层心肌细胞RMP、APA 和APD90变化趋势变化可见逐渐表现更低或先升高后减低的不同，详见图2 所示。

图2 外膜层心肌细胞RMP、APA 和APD90变化趋势对比

表2 心室M 细胞及外膜层心肌细胞RMP、APA 和APD90 基础值分布特征

2.3 钾离子、镁离子的影响作用分析本研究中浸浴液K+浓度为75 mmol/L 和145 mmol/L，实验条件下达到钾的平衡电位；当膜电位高于此平衡电位后，电流可见转成外向，但幅值很小；继续增大膜电位后，电流幅值并不继续增大。进一步观察，细胞内Mg2+浓度对内向整流作用的影响：在无Mg2+浸浴液的条件下，I⁃V 曲线呈一准曲线，表明内向整流作用不明显。当浸浴液含1 mmol/L Mg2+时，内向电流无影响，而外向电流受到明显抑制，从而出现明显内向整流特点。同时，本实验证实，当移去细胞内Mg2+时内向整流特性几乎完全消失。

3 讨论

近10 余年来，慢性肾脏病的发病率在全球范围内迅速增长，并已呈现流行趋势，它不仅是原发性肾脏疾病，也可出现在高血压、糖尿病等其他疾病的中、晚期阶段［9］，我国有一线城市≥40岁人群的流行病学调查［10］显示CKD 的发病率已达接近10%的水平。在CKD 患者中，由于神经、体液、内分泌、代谢等多方面的改变，可以出现包括心室收缩、舒张功能改变在内的多种心脏受损的表现，或加重患者原有心脏病受损伤的程度。心力衰竭（heart failure，HF）也是常见的心脏损害表现，其不仅是许多心血管疾病发展的终末阶段，也是心血管疾病患者的重要死亡原因之一［11⁃14］。

本研究中，我们对对照组及CKD 动物模型进行了观察，光镜下可见对照组心肌纤维整体排列清晰整齐；心肌细胞呈短柱状，结构完整，染色较均匀，心肌纤维纹理清晰，排列整齐，粗、细心肌纤维相间。CKD 组心肌纤维排列尚清晰；心肌细胞分布弥散，结构尚完整，染色欠均匀，细胞核可见破碎、溶解，核两端肌浆分散，并可见周围心肌细胞与之相溶，心肌纤维呈波浪状且排列紊乱，局部肌纤维可见空泡变性以及出血。另外，行心电图检测可见CKD 组T 波振幅总水平低于对照组水平；CKD 组Tp⁃Te 以及Tp⁃Ted 总水平均高于对照组（均P<0.05）。CKD 组内不同病期对比，1～4 期T 波振幅高于5 期水平，Tp⁃Te 以及Tp⁃Ted 均低于5 期水平（均P<0.05）。提示存在CKD（心肌缺血）时，Tp⁃Te 间期和Tp⁃Ted 增大，Tp⁃Te 间期和Tp⁃Ted可作为反映跨壁复极离散度的无创性指标。

心室外膜、中层及内膜层心肌细胞间存在电生理异质性，而中层细胞具有APD 长、复极延缓的特性，心室不同层细胞间存在跨室壁复极不均一性，这一差异成为在病理条件下触发后除极及折返性心律失常的主要原因［15⁃17］。本研究发现不同心肌细胞RMP、APA 和APD90基础值差别未见统计学意义。随着时间点变化，CKD 组及对照组的外膜层心肌细胞RMP、APA 和APD90变化趋势变化可见逐渐表现更低或先升高后减低的不同。本研究进一步对相关机制进行了探索，浸浴液K+浓度为75 mmol/L 和145 mmol/L，实验条件下达到钾的平衡电位；当膜电位高于此平衡电位后，电流可见转成外向，但幅值很小；继续增大膜电位后，电流幅值并不继续增大。说明该离子流为K+携带，成内向整流，与文献报道一致。进一步观察到，细胞内Mg2+浓度对内向整流作用的影响：在无Mg2+浸浴液的条件下，I⁃V 曲线呈一准曲线，表明内向整流作用不明显。当浸浴液含1 mmol/L Mg2+时，内向电流无影响，而外向电流受到明显抑制，从而出现明显内向整流特点。内向整流作用相关机制一方面与“门的电压依赖性”去激活作用有关，另一方面与细胞内镁离子等对激活门的阻滞作用紧密关联。IKATP敏感性钾通道（IKATP）等钾通道的内向整流作用均表现出细胞内Mg2+浓度依赖性。同时，本实验证实，当移去细胞内Mg2+时内向整流特性几乎完全消失。

综上所述，CKD 兔心肌跨壁复极离散的变化对心电图T 波的形态有重要影响；希望基于此可以为临床医师在CKD 心血管病变病程评估、疗效判断方面提供一种更为简便、可行、无创的辅助检查方法。