NLRP3 在脑缺血再灌注损伤中的作用及其与自噬的关系

王 卓 张 静 王慧娟 雷佳羲 詹丽英

武汉大学人民医院1麻醉科，2重症医学科 湖北 武汉 430060

脑卒中（stroke）是一种急性脑血管疾病，主要表现为脑血管病变引起的脑组织损伤及相关的神经功能缺损，以缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）最常见，具有高发病率、高致死率、高致残率等特点，近年来甚至出现年轻化趋势，给患者和家庭带来巨大负担［1，2］。临床上治疗IS 的原则是尽早恢复血液再灌注，但静脉溶栓和机械取栓手术均受限于时间窗，无法实现大多数患者的及时救治［3］。另外，再灌注治疗还容易引起脑水肿、脑出血及神经元死亡等继发性脑损伤，这种现象被称为脑缺血再灌注损 伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）［4］。临床上也曾尝试开展神经保护药物实验，但绝大多数都未成功［5］。缺血性脑损伤涉及离子失衡、能量代谢障碍、氧化/硝化应激、兴奋性氨基酸细胞毒性、炎症反应等多个病理过程，最终导致细胞发生自噬、凋亡及铁死亡等［6］，给治疗药物的临床转化带来了巨大困难。因此，深入研究缺血性脑卒中的发病机制是挽救更多缺血性脑卒中患者的关键。

自噬在真核细胞中广泛存在，是破坏胞内病原体、清除和重新利用受损蛋白质和细胞器的重要过程［7］。自噬参与缺血性脑卒中的发生发展，但其发挥的作用尚存争议，一方面有研究认为自噬对缺血性脑损伤具有保护作用，增强自噬可以提高应激，增加缺氧缺血条件下细胞存活率［8］；另一方面也有研究认为自噬会加重缺血性脑损伤，过度激活自噬还可能造成血脑屏障通透性增加、细胞功能障碍，甚至促进细胞死亡［9］。

NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD⁃like receptor thermal protein domain associated pro⁃tein 3，NLRP3）炎症小体是炎症反应的重要调节器，在IS 中明显被活化，并在组装和活化过程中加工并释放大量白细胞介素（interleukin，IL）⁃1β、IL⁃18，放大炎症反应［10］。以往的研究表明NLRP3 炎症小体与自噬关系密切，自噬可以影响NLRP3 炎症小体的活化，反过来，为平衡宿主防卫炎症反应和防止过度炎症，NLRP3 炎症小体也会调节自噬过程［11］。但自噬和NLRP3 炎性小体在IS 中具体机制尚不明确，自噬和NLRP3 炎性小体之间是如何相互作用影响IS 的，还有待进一步研究。

本实验利用野生型（wild type，WT）C57BL/6J小鼠和NLRP3 基因敲除型（NLRP3 knockout type，NLRP3 KO）小鼠构建短暂性大脑中动脉阻塞（tran⁃sient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）模型，观察缺血1 h 再灌注72 h 后小鼠神经功能评分、脑血流灌注情况、脑梗死体积及脑组织中炎症相关蛋白NLRP3、IL⁃1β 及自噬相关蛋白Beclin⁃1、LC3β等表达情况，探究NLRP3 基因敲除是否可以通过抑制自噬改善IS 后脑缺血再灌注损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级健康雄性WT C57BL/6J小 鼠48 只，NLRP3 KO C57BL/6J 小 鼠45 只，6～8周龄，体质量20～25 g。WT C57BL/6J 小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号为SCXK（湘）2019⁃0004，NLRP3 KO 小鼠由武汉大学人民医院心内科实验室赠予。本动物实验已通过武汉大学人民医院实验动物福利伦理委员会批准，严格遵循动物实验伦理要求。

1.2 模型建立和分组小鼠于SPF 级恒温（24～26 ℃）恒湿（60%～80%）环境中饲养，每日各12 h规律昼夜交替，食水充足。造模前适应性饲养1 周。采用随机数字表法将WT 和NLRP3 基因敲除型小鼠分为野生型假手术组（WT Sham 组）、野生型造模组（WT MCAO 组）、NLRP3 敲除型假手术组（NLRP3 KO Sham 组）和NLRP3 敲除型造模组（NLRP3 KO MCAO 组），每组20 只。所有小鼠在造模前禁食12 h，饮水自由。小鼠采用5%异氟烷吸入麻醉，术中氧流量维持在4～6 L/min，异氟烷MAC 值在1%～1.5%以维持麻醉深度。剃毛，皮肤乙醇消毒后，打开颈部皮肤，暴露左侧颈内动脉，插入6⁃0 单丝结扎左侧颈总动脉和颈外动脉，颈总动脉头侧端开口，沿颈内动脉置入线栓。阻断60 min 后，取出线栓进行再灌注。手术中使用恒温加热垫监测并将小鼠体温稳定在（37.0±0.5）℃。Sham 组小鼠分离颈部血管，不置入线栓，其他操作步骤同MCAO 组。

1.3 神经功能学评分神经功能学评分采用Lon⁃ga 评分法，由单盲观察者于小鼠大脑中动脉阻塞后72 h 评定。标准如下：正常，无神经功能障碍（0分）；轻度神经功能障碍，右侧（梗死半球对侧）前爪不能完全伸展（1 分）；中度神经功能障碍，行走时向右侧转圈（2 分）；严重神经功能障碍，行走时向右侧倾倒（3 分）；无法自发行走，存在意识障碍（4 分）。

1.4 脑血流成像造模72 h 后，将各自小鼠分批次放入5%异氟烷吸入麻醉，剔除头部毛发，皮肤消毒后，打开头部皮肤，滴入少量生理盐水于头部，超声下显示脑血流成像，观察小鼠大脑缺血再灌注情况，用激光斑点血流成像软件（SIM BFI Software 软件）拍摄并记录各组小鼠大脑血流成像照片。

1.5 TTC 染色为了评估MCAO 造模是否成功和NLRP3 基因敲除对小鼠脑梗死体积的影响，采用2% 2，3，5⁃三苯基四氮唑氯化物（2，3，5⁃triphen⁃yltetrazolium chloride，TTC）染色观察WT MCAO组和NLRP3 KO MCAO 组之间的梗死体积。小鼠脑缺血再灌注72 h 后，放入2%异氟醚的麻醉盒中麻醉，待小鼠深度麻醉后快速断头处死，取出大脑组织，置于小鼠脑切片模具中，在-20 ℃下冷冻，30 min 后，将小鼠大脑组织切成4 块冠状切片，在37 ℃的TTC 中避光水浴15 min。4 个切片在4%多聚甲醛中浸泡1 h，将切片平铺于纯色版上扫描，经TTC染色后，正常脑组织显示红色，梗死区域显示白色，每一脑片梗死面积乘以2 mm 厚度得到一片脑片梗死体积，再将各脑片数值相加后得到梗死总体积，梗死体积百分比=（梗死总体积/脑部总体积）×100%，用Image J 软件由单盲观察者测定脑梗死体积百分比。

1.6 Western Blot 检 测MCAO 后72 h，从4 组 各随机取6 只小鼠处死，取左侧半球梗死区脑组织（Sham 组取未梗死区域同一位置），称重，按1∶10（g/mL）加入RIPA 裂解液冰上裂解30 min 后匀浆，低温高速（4 ℃，12 000 r/min）离心15 min，取上清液，采用BCA 测定试剂盒测定提取的总蛋白浓度，加入5×上样缓冲液，震荡混匀，水浴锅煮15 min，12% SDS⁃PAGE 凝胶电泳分离蛋白后转移至PVDF 膜上，用5% BSA 室温封闭1 h；加入以下一抗：NLRP3（1∶1 000，Affinity，中 国），IL⁃1β（1∶1 000，Affinity，中国），Belcin⁃1（1∶1 000，Affinity，中国），LC3β（1∶1 000，Affinity，中国）和GAPDH（1∶1 000，Biosharp，中国），置于4 ℃冰箱摇床孵育过夜。次日，用TBST 洗3 次，每次10 min，将条带置入含有辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔二抗（1∶3 000，Proteintech，中国）孵育液中，室温摇床孵育1 h，TBST 洗涤3 次，每次10 min，使用新鲜的ECLA/B 显影液进行化学发光成像。采用Image J 软件测量蛋白条带灰度值。

1.7 统计学处理采用GraphPad Prism 8.0.2 统计软件对数据进行统计分析和绘图，所有数据以均数±标准差（±s）表示，神经功能评分和TTC 染色结果组间差异采用非配对t检验统计分析。其他测量数据各组间差异使用双因素方差分析（Two⁃way ANOVA）并进行Bonferroni 事后检验，P<0.05 被认为有显著性差异。

2 结果

2.1 WT 小鼠和NLRP3 敲除小鼠造模后神经功能评分比较缺血1 h 再灌注72 h 后，从造模后的WT小鼠和NLRP3 KO 小鼠中随机选择各8只，沿用Lon⁃ga 评分法对其进行神经功能学评分，结果发现，与WT MCAO 组相比，NLRP3 KO MCAO 组神经功能评分明显降低（P<0.05），说明NLRP3基因敲除可显著降低MCAO 后小鼠神经功能评分。见图1。

图1 WT MCAO组和NLRP3 KO MCAO组神经功能评分

2.2 WT 小鼠和NLRP3 敲除小鼠脑血流成像比较与Sham 组相比，MCAO 组小鼠左侧大脑血流明显降低，表明MCAO 手术模型造模成功。与WT MCAO 组 相 比，NLRP3 KO MCAO 组 小 鼠 大脑血流可见明显改善，说明NLRP3 敲除可改善小鼠MCAO 后大脑血流灌注。见图2。

图2 WT 小鼠和NLRP3 敲除小鼠脑血流成像

2.3 WT 小鼠和NLRP3 敲除小鼠MCAO 后梗死灶体积比较缺血1 h 再灌注72 h 后，用2%TTC对脑组织切片染色，结果发现，与WT 小鼠相比，NLRP3 基因敲除小鼠造模后脑梗死体积明显减小（P<0.01），说明NLRP3 基因敲除能够显著降低小鼠脑梗死体积。见图3。

图3 WT 小鼠和NLRP3 KO 小鼠MCAO 术后脑梗死体积

2.4 各组小鼠大脑组织中NLRP3、Beclin⁃1、IL⁃1β 和LC3β 蛋白表达比较Western Blot 结果显示：与WT Sham 组相比，WT MCAO 组小鼠脑组织NLRP3、Beclin⁃1、IL⁃1β 和LC3β 的蛋白表达上调（P<0.001）；与NLRP3 KO Sham 组 相 比，NLRP3 KO MCAO 组小鼠脑组织NLRP3（P<0.05）、Be⁃clin⁃1（P<0.001）、IL⁃1β（P<0.001）和LC3β（P<0.001）的蛋白表达上调；与WT Sham 组相比，NLRP3 KO Sham 组小鼠脑组织NLRP3（P<0.001）和IL⁃1β（P<0.001）的蛋白表达下调，而Be⁃clin⁃1 和LC3β无显著性差异（P>0.05）；与WT MCAO 组相比，NLRP3 KO MCAO 组小鼠脑组织NLRP3、Beclin⁃1、IL⁃1β 和LC3β 的蛋白表达下调（P<0.001）。见图4。

图4 各组小鼠NLRP3、Beclin⁃1、IL⁃1β 和LC3β 蛋白的表达情况

3 讨论

先前研究表明IS 造成的脑组织不可逆性损伤会导致严重神经功能障碍［12］，故本研究参照文献［13］采用的手术方式对WT 小鼠和NLRP3 KO 小鼠制造MCAO 模型后拟通过神经功能评分，在体脑血流成像和TTC 染色验证小鼠造模是否成功。缺血1 h 再灌注72 h 后通过Longa 评分法评估小鼠神经功能评分，结果发现，相比WT MCAO 组，NLRP3 KO MCAO 组神经功能评分显著降低；再灌注72 h 后观察并记录小鼠脑血流成像，结果发现，NLRP3 KO MCAO 组大脑血流灌注情况较WT MCAO 组明显改善；随后用TTC 染色并测量WT MCAO 组和NLRP3 KO MCAO 组左侧大脑半球梗死灶体积，结果发现，NLRP3 KO MCAO 组脑梗死体积显著减少，以上结果提示MCAO 模型制备成功，并且发现NLRP3 基因敲除能明显增加小鼠脑血流灌注，减少脑梗死体积并改善卒中后神经功能。

IS 发生后神经元死亡的机制十分复杂，在脑梗死中央区出现不可逆坏死［14］，但由于侧支循环的存在，梗死中心周围区的神经死亡相对延迟、进一步损伤和死亡过程或可被逆转，这个区域被称为缺血半暗带［15］。脑缺血损伤后缺血半暗带区神经元的抢救刻不容缓，而自噬对缺血半暗区神经元的存活又至关重要［16］。因此，在IS 过程中充分认识自噬的变化并调控自噬或许是改善IS 预后的一个重要切入点。

自噬是一种细胞内保护机制，受自噬相关基因（autophagy⁃related gene，Atg）的多种蛋白调控，包括哺乳动物细胞酵母Atg6 的同源基因Beclin⁃1 和Atg8 的同源基因微管相关轻链3（microtubule asso⁃ciated light chain 3，LC3），Beclin⁃1、LC3β 表达水平大小可反映自噬水平的高低［17］。自噬作为真核细胞对外界刺激的一种反应，与固有免疫系统和适应性免疫系统有关，因此，它也与NLRP3 炎性小体密切相关［11］。有研究报道自噬可以促进NLRP3 活化和释放，也有研究报道自噬可以抑制NLRP3 活化，还有研究发现NLRP3 炎症小体也可以反过来作用于自噬。本研究通过用Western Blot 检测各组小鼠脑组织Beclin⁃1 和LC3β 蛋白表达水平判断IS 发生前后自噬水平的变化以及NLRP3 基因敲除对IS 后自噬水平的影响。结果显示，WT MCAO 组小鼠缺血1 h 再灌注72 h 后脑组织中Beclin⁃1 和LC3β 的蛋白表达明显上调，说明IS 发生后小鼠脑组织中自噬加重；而相比于WT 小鼠，NLRP3 KO 小鼠MCAO后 脑 组 织Beclin⁃1 和LC3β 表达明显降低，说明NLRP3 基因敲除能够抑制脑缺血损伤后自噬的发生。虽然自噬一般被认为在IS 中发挥神经保护作用，但近年来越来越多的证据表明缺血再灌注的自噬可导致IS 后神经元死亡［18］。自噬在缺血和再灌注过程中可能发挥双重作用：缺血时具有保护作用，再灌注时具有损害作用［8，19］。基于本研究实验结果，我们推测NLRP3 基因敲除可能通过抑制自噬改善CIRI，对小鼠IS 后神经功能起到了保护作用。

综上所述，本研究发现NLRP3 和自噬参与了小鼠IS 的发生发展，NLRP3 敲除可以抑制自噬、减轻CIRI 并有效改善神经功能。NLRP3 抑制IS 后自噬的具体机制仍需进一步研究探索。