安石榴苷通过Akt/NF⁃κB/Cyclin D1 通路对幼龄哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

王 莹 王荣环 谢 意

天津医科大学第二医院药剂科 天津 300211

哮喘是儿童慢性呼吸道疾病，慢性气道炎症和气道高反应性是其主要特征，气道重塑是其最重要的病理性特点［1，2］。一线药物吸入型糖皮质激素能改善儿童哮喘症状，但不能改变疾病进程并预防哮喘复发［3，4］。气道平滑肌细胞（airway smooth mus⁃cle cell，ASMC）其恶性增殖是气道重塑的重要基础［5］。蛋 白 激 酶B（protein kinase B，Akt）/核 因子⁃κB（nuclear factor⁃κB，NF⁃κB）/细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）通路是炎症引发细胞增殖的重要途径，Akt 磷酸化后可激活NF⁃κB，导致NF⁃κB 磷酸化后调节炎症反应，同时上调Cyclin D1 表达，加快细胞周期进程［6，7］。安石榴苷是从石榴果皮中提取的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等作用［8］。研究显示，安石榴苷能缓解慢性支气管炎大鼠体内的炎性反应，但对哮喘的影响尚无人研究［9］。本研究将探究安石榴苷对幼龄哮喘大鼠ASMC 增殖、凋亡及Akt/NF⁃κB/Cyclin D1 通路的影响，以期为治疗儿童哮喘提供新依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 3 周龄SD 雄性大鼠，体质量90～100 g，购自肇庆市瑞思元生物科技有限公司，许可证号：SCXK（粤）2020⁃0053。在温度20～25 ℃、自由饮食饮水条件下适应性喂养7 d。

1.1.2 主要试剂 氢氧化铝、卵白蛋白、Annexin V⁃FITC/PI 试剂盒（北京百奥莱博）；安石榴苷、HE试剂盒、CCK⁃8 试剂（北京索莱宝）；兔抗p⁃Akt、兔抗Akt、兔抗NF⁃κB p⁃p65、兔抗NF⁃κB p65、兔 抗Cy⁃clin D1、兔抗GAPDH、山羊抗兔（杭州戴格公司）。

1.1.3 主要仪器 AH⁃2 型显微镜（日本Olym⁃pus）；SynergyH 1 型酶标仪（美国BioTek）；BD FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪（美国BD）；Alpha View 型凝胶成像系统（美国Protein Simple）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与哮喘大鼠模型制备 幼龄大鼠随机分为正常组、哮喘组和安石榴苷低、中、高剂量组，每组10 只。按照文献［10］制备哮喘模型，出现口唇发绀、腹肌抽搐、呼吸急促及站立不稳等现象代表哮喘模型建立成功。

1.2.2 实验给药 于激发过程第1 天开始给药，安石榴苷低、中、高剂量组灌胃10、20、40 mg/kg 安石榴苷［9］，正常组、哮喘组灌胃等量生理盐水，每天1次，连续4 周。

1.2.3 大鼠一般情况观察 给药结束后24 h 内，记录幼龄大鼠体质量及临床症状，测定肺功能，计算出大鼠最大呼气流量（peak expiratory flow，PEF）及0.2 秒用力呼气容积占用力肺活量比率（ratio of forced expiratory volume at 0.2 second and forced vi⁃tal capacity，FEV0.2/FVC）。

1.2.4 HE 染色观察大鼠肺组织学 给药结束后24 h 内将大鼠处死取材。开胸迅速分离肺组织，右侧肺组织以液氮冻存待检；左侧肺组织用多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，厚度5 µm，HE 染色观察。

1.2.5 哮喘大鼠ASMC 的分离、培养及分组 取1只哮喘模型大鼠，用10%水合氯醛（40 mg/kg）麻醉，在无菌条件下分离气道平滑肌组织，组织贴壁法培养ASMC，差速贴壁法纯化细胞［11］，在含20%胎牛血清及双抗的DMEM 培养基中培养、传代。

取第5 代ASMC 5×104个/mL 接种于细胞培养板，分为对照组和安石榴苷低、中、高浓度组，分别加入0、100、200、400 μmol/L 的安石榴苷［12］。

1.2.6 CCK⁃8 法检测细胞增殖 细胞培养48 h，加入10 μL CCK⁃8 试剂，培养2 h，使用酶标仪（波长450 nm）检测各孔吸光度（A）值。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞培养48 h，收集细胞并用结合缓冲液调整为1×106个/mL，按Annexin V⁃FITC/PI 试剂盒说明书步骤进行操作，使用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.2.8 Western Blot 检测肺组织、ASMC 中Akt/NF⁃κB/Cyclin D1 通路相关蛋白表达 收集培养48 h 后的ASMC，提取右侧肺组织及细胞中总蛋白，BCA 法定量，10% SDS⁃PAGE 电泳分离蛋白，转移至PVDF 膜后封闭1 h，加入一抗（兔抗p⁃Akt、兔抗Akt、兔抗NF⁃κB p⁃p65、兔抗NF⁃κB p65、兔抗Cy⁃clin D1、兔抗GAPDH，均1∶100），4 ℃孵育过夜，加入二抗（山羊抗兔，1∶2 000）孵育1 h，化学发光法显色，凝胶成像系统扫描图像，分析条带灰度。

1.3 统计学分析采用SPSS 24.0 软件进行统计学分析，P<0.05 为差异有统计学意义。数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK⁃q检验。

2 结果

2.1 幼龄大鼠一般情况图1 显示，与正常组相比，哮喘组体质量、PEF、FEV0.2/FVC 降低；与哮喘组相比，安石榴苷低、中、高剂量组体质量、PEF、FEV0.2/FVC 升高，且呈剂量依赖（P<0.05）。

图1 各组体质量、PEF、FEV0.2/FVC 的比较

2.2 肺组织学观察正常组肺组织黏膜上皮完整，支气管管腔及肺泡形态规则，无炎性细胞浸润及气管平滑肌增厚现象；哮喘组肺组织黏膜上皮破损，可见大量的炎性细胞浸润及明显的气管平滑肌增厚；安石榴苷低、中、高剂量组肺组织中炎性细胞浸润、气管平滑肌增厚情况逐渐减轻（图2）。

图2 HE 染色观察各组肺组织学情况（×200）

2.3 肺组织中Akt/NF⁃κB/Cyclin D1 通路相关蛋白表达情况图3 显示，与正常组相比，哮喘组肺组织p⁃Akt/Akt、NF⁃κB p⁃p65/NF⁃κB p65、Cyclin D1/GAPDH 蛋白表达水平升高；与哮喘组相比，安石榴苷 低、中、高 剂 量 组 肺 组 织p⁃Akt/Akt、NF⁃κB p⁃p65/NF⁃κB p65、Cyclin D1/GAPDH 蛋 白表达水平降低，且呈剂量依赖（P<0.05）。

图3 各组肺组织中蛋白表达水平

2.4 各组ASMC增殖情况见图4。与对照组相比，安石榴苷低、中、高浓度组ASMC 的A值降低；随着安石榴苷浓度的升高，ASMC的A值降低（P<0.05）。

图4 各组ASMC 增殖情况（A 值）的比较

2.5 各组ASMC 凋亡情况图5 显示，与对照组相比，安石榴苷低、中、高浓度组ASMC 凋亡率升高，且呈剂量依赖（P<0.05）。

图5 各组ASMC 凋亡情况及凋亡率比较

2.6 ASMC 中Akt/NF⁃κB/Cyclin D1 通路相关蛋白表达情况图6 显示，与对照组相比，安石榴苷低、中、高浓度组ASMC 细胞中p⁃Akt/Akt、NF⁃κB p⁃p65/NF⁃κB p65、Cyclin D1/GAPDH 蛋白表达水平降低，且呈剂量依赖（P<0.05）。

图6 各组ASMC 的蛋白表达水平比较

3 讨论

哮喘是常见于儿童的慢性呼吸道疾病，为了模拟儿童哮喘，本研究选用幼龄大鼠作为实验动物，并通过氢氧化铝、卵白蛋白诱导建立幼龄哮喘大鼠模型，成功建立了哮喘大鼠模型。

安石榴苷具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎等多种活性［13］。研究发现，安石榴甙在脂多糖诱导的RAW264.7 巨噬细胞炎症反应中起抗炎作用［14］。本研究提示安石榴苷可抑制ASMC 增殖并诱导其凋亡，即其可抑制ASMC 的恶性增殖状态。Akt/NF⁃κB/Cyclin D1 通路调节炎症反应及细胞增殖、凋亡进程，Akt 通路激活后可通过激活NF⁃κB，上调其磷酸化表达并使其从细胞质中转至细胞核，进而上调Cyclin D1 表达促进细胞增殖［15］。本研究发现，哮喘组幼龄大鼠肺组织中p⁃Akt/Akt、NF⁃κB p⁃p65/NF⁃κB p65、Cyclin D1/GAPDH 蛋白表达水平较正常组升高，提示Akt/NF⁃κB/Cyclin D1 通路参与哮喘发病过程。使用安石榴苷作用于幼龄哮喘大鼠及其ASMC，可降低肺组织及ASMC 相关蛋白表达水平，提示安石榴苷可抑制Akt/NF⁃κB/Cy⁃clin D1 通路的激活，可能与抑制ASMC 细胞恶性增殖进而减轻气道重塑有关。

综上所述，安石榴苷可减轻幼龄哮喘大鼠气道重塑病理状态，抑制ASMC 增殖并诱导其凋亡，其机制可能与抑制Akt/NF⁃κB/Cyclin D1通路激活有关。