CircRNA-32011调控三氧化二砷诱导的心肌细胞凋亡

马文俊，尚爱晶，常 琳，程文政，吴继臣，官晓翔，张 荣，姜 媛，刘嘉祺，付 惠，王 莹，许超千

(1．牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.哈尔滨医科大学药学院，北方转化医学研究合作中心，黑龙江 哈尔滨 150086)

三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是砷的无机化合物，同时作为中药砒霜的有效成分，也是治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)最有效药物之一，并且ATO在我国已经作为临床治疗APL的首选药物之一[1]。研究显示[2]，ATO在治疗急性早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤及其他恶性肿瘤方面均取得良好的效果。但是，有临床数据表明长期暴露于治疗剂量的ATO会诱发严重的不良反应，例如心脏毒性、消化道症状以及肾损害，其中严重的心脏毒性阻碍了ATO在临床的广泛应用，因此我们有必要针对ATO引起心脏毒性的机制进行深入探索。

环状RNAs(circRNAs)与传统的线性RNA不同，其不具有5′末端帽子和3′末端polyA尾巴，通常由蛋白质编码基因的外显子、内含子、外显子-内含子和tRNA内含子区域通过RNA 3′端和5′端的外显子或内含子环化产生。CircRNAs分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解[3]。近年来[4]，多项研究表明，circRNAs可参与调控心肌细胞凋亡。例如，Cui等[5]发现采用过氧化氢刺激H9C2细胞，circNFIX的表达明显下调。过表达circNFIX可抑制过氧化氢诱导的H9C2细胞凋亡。CircSAMD4A抑制miR-138-5p的表达，促进缺氧/复氧诱导的H9C2细胞凋亡和炎症反应[6]。沉默Circ-0062389可通过调节TGF-β1/Smad3信号通路缓解大鼠心力衰竭中心肌细胞凋亡[7]。

本研究首先验证ATO诱导心肌细胞凋亡并通过基因芯片筛选出差异表达的circRNA-32011；进一步探究circRNA-32011在ATO诱导心肌细胞凋亡中的作用，为预防和治疗ATO引起的心脏损伤提供理论依据和治疗思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂本实验采用的ICR乳鼠(1～3 d)由牡丹江医学院实验动物中心提供；DMEM培养基(01-052-1ACS)、特级胎牛血清(04-001-1A)和DPBS(02-023-1ACS)购自以色列Bioind公司；LipofectamineTM2000试剂盒(11668-019)购自Thermo Fisher Sci-entific；qPCR RT Kit(FSQ-101)、SYBR Green PCR Master Mix(QPK-201)购自上海东洋纺生物科技有限公司；Ⅱ型胶原酶(17101-015)购自美国Gibco公司；Anti-β-actin(20536-1-AP)、Anti-BAX(50599-2-Ig)、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(SA00001-2-100 μL)购自中国武汉三鹰生物技术有限公司；Anti-Bcl-2(A19693)购自中国Abclonal公司；CircRNA-32011质粒购自上海吉凯基因股份有限公司；Si-CircRNA-32011购自广州锐博生物科技有限公司。

1.2 仪器荧光定量PCR系统购自美国应用生物系统公司；AI600扫描成像系统购自美国GE公司；酶标仪购自美国MD SpectraMax公司。

1.3 原代心肌细胞培养取1～3 d的新生乳鼠(25～30只)开胸摘取心脏，置于预冷的已加入双抗的PBS中，巴氏吸管将心脏和液体吸入15 mL离心管，弃掉液体后加入D′hanks液冲洗，加入3 mL D′hanks液和2 mL低温胰酶，放于4 ℃摇床8～12 h。配置Ⅱ型胶原酶。8～12 h后弃掉液体，加入7 mL配好的Ⅱ型胶原酶，37 ℃摇床恒温摇10 min后吸取上清，整个过程重复3次。将离心管中上清液离心，1 000 r·min-1,5 min，弃上清，沉淀加入完全培养基，轻吹打加入培养瓶。1.5 h后收集完全培养基到6孔板，6孔板中即原代心肌细胞。细胞在含有10% FBS的DMEM培养基中,在37 ℃的含5% CO2的细胞培养箱中培养，待细胞融合度达到70%～80%后弃上清液，进行后续转染，稳定转染24 h后进行相关实验。

1.4 细胞转染与分组用Lipofectamine 2000试剂转染CircRNA-32011及其阴性对照。针对CircRNA-32011设计并合成si-RNA及其阴性对照。构建CircRNA-32011的过表达载体。将乳鼠原代心肌细胞按实验要求，转染siRNA则为以下各组：(1)Control组：正常对照组；(2)siRNA组；(3)NC组。转染过表达质粒则为以下各组：(1)Control组：正常对照组；(2)过表达质粒组；(3)Vector组。

1.5 MTT将心肌细胞接种在96孔培养板中，并在37 ℃下用5%CO2孵育。处理后，进行MTT测定，向每个孔中加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)并孵育4 h。然后将Formazan晶体溶解在200 μL DMSO中。用酶标仪在490 nm处测量吸光度值。

1.6 RT-PCR用TRIzol试剂提取细胞中的总RNA，并逆转录合成cDNA。RT-PCR采用实时荧光定量PCR系统进行。用2-△△Ct法计算基因的相对表达水平。具体操作方法参照文献进行，以β-actin作为内参，引物序列如下。

1.7 Western blot取“1.4”中分组的心肌细胞，弃培养基,用预冷的PBS洗涤细胞2次，吸干残留液体每孔加100 μL 1× RIPA裂解液，用细胞刮刀将细胞刮落并收集，冰上继续裂解20 min，12 000×g，4 ℃离心15 min。将上清液转移至新1.5 mL EP管内，BCA法测蛋白浓度，然后将蛋白样品与6×上样缓冲液混匀后，100 ℃变性10 min，进行 SDS-PAGE 蛋白电泳，在冰浴条件下300 mA，1 h转膜。转膜结束后，用PBST洗膜3次，快速封闭液封闭10 min，用1 ∶1 000比例配制的一抗在4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，用1 ∶10 000比例配制的二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，ECL化学发光法显影，使用ImageJ软件进行半定量分析，以目标蛋白条带的吸光度值与内参蛋白条带吸光度值比值表示Bax、Bcl-2蛋白相对表达水平，Bax与Bcl-2吸光度比值表示细胞凋亡水平。

Tab 1 RT-PCR primer sequences

1.8 统计学分析所有实验数据应用单因素方差分析(One-way ANOVA)以及t-检验(t-test)对所得数据进行分析。使用GraphPad Prism 8.0软件对数据统计分析并制作图表。

2 结果

2.1 三氧化二砷促进心肌细胞凋亡采用不同浓度的ATO(1、5、10、15 μmol·L-1)处理乳鼠原代心肌细胞24 h，通过MTT检测心肌细胞活力，结果显示ATO终浓度为10 μmol·L-1时心肌细胞活力明显下降(P<0.01)(Fig 1A)。此外，通过Western blot和RT-PCR分别检测细胞凋亡相关指标Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白水平变化，结果显示,与control组相比，ATO组Bcl-2/Bax mRNA(Fig 1B)和蛋白(Fig 1C)明显降低(P<0.01)。以上结果表明ATO促进心肌细胞凋亡。

2.2 CircRNA-32011在ATO作用的心肌细胞中表达下调为探究circRNAs在ATO诱导的心肌细胞凋亡中的调控作用，我们从缺血心肌组织circRNAs差异表达芯片结果中筛选出3条低表达(具有潜在心脏保护功能)的circRNAs(CircRNA-41355、CircRNA-31781以及CircRNA-32011)，通过RT-PCR检测ATO处理的心肌细胞中这3条circRNAs表达变化，结果显示，与control组相比，ATO组circRNA-32011表达明显下调(P<0.01)(Fig 2A)，因此，选

Fig 1 Myocardial cell apoptosis promoted by arsenic trioxide A:Cell viability of cardiomyocytes detected by MTT assay,.B:MRNA levels of Bcl-2/Bax detected by RT-PCR,scale:10 μmol·L-1.C.Protein levels of Bcl-2/Bax measured by Western blot,scale:10 μmol·L-1,*P<0.05,**P<0.01 vs control.

Fig 2 CircRNA-32011 down-regulated in ATO-induced myocardial apoptosis A:MRNA levels of circRNAs detected by n=5 ),**P<0.01 vs control.B:CircRNA-32011 cyclization sites verified by Sanger sequencing.C:The stability of CircRNA-32011 verified by agarose gel electrophoresis after RNaseR treatment.

择circRNA-32011作为后续研究对象。通过Sanger测序证实circRNA-32011存在反向剪切位点(Fig 2B)；核酸外切酶R(RNaseR)实验结果显示，与线性亲本基因相比，circRNA-32011能够抵抗RNaseR的消化，表明circRNA-32011具有稳定的环状结构(Fig 2C)。

2.3 过表达circRNA-32011抑制ATO诱导心肌细胞凋亡作用为探究circRNA-32011对ATO诱导心肌细胞凋亡的影响，我们构建了circRNA-32011过表达质粒。首先将circRNA-32011过表达质粒转染至正常乳鼠原代心肌细胞。RT-PCR检测显示相比于对照组circRNA-32011上调了17.63±0.1倍(P<0.05)(Fig 3A)。利用MTT、RT-PCR及Western blot分别检测心肌细胞活力和凋亡相关基因(Bax和Bcl-2)的mRNA和蛋白表达情况，结果显示，生理条件下，与vector组相比，过表达circRNA-32011后，心肌细胞活力和Bcl-2/Bax均无明显变化(Fig 3B-D)，提示circRNA-32011在生理条件下对心肌细胞无损伤作用。接下来，我们过表达circRNA-32011后予以ATO干预。通过MTT检测发现与control组进行相比，ATO组能够明显降低心肌细胞活力，而过表达circRNA-32011逆转这一现象(P<0.01)(Fig 3E)。RT-PCR及Western blot检测结果显示，与ATO组相比，过表达circRNA-32011明显抑制ATO诱导的Bcl-2/Bax下调(P<0.01)(Fig 3F-G)。以上结果表明，过表达circRNA-32011可抑制ATO诱导的心肌细胞凋亡。

Fig 3 ATO-induced apoptosis in cardiomyocytes inhibited by overexpression of n=5 )A:MRNA levels of circRNAs dected by RT-PCR,**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs vector.B:Cell viability after transfection with circRNA-32011 plasmid.C:MRNA levels of Bcl-2/Bax detected by RT-PCR.D:Protein levels of Bcl-2/Bax measured by Western blot.E:Cell viability detected by MTT assay,**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs vector.F:MRNA levels of Bcl-2/Bax detected by RT-PCR;*P<0.05,**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs ATO+vector.G:Protein levels of Bcl-2/Bax measured by Western blot,**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs ATO+vector.

2.4 敲减circRNA-32011促进ATO诱导心肌细胞凋亡作用为进一步明确circRNA-32011对ATO诱导心肌细胞凋亡的影响，采用特异性siRNA沉默内源性circRNA-32011。RT-PCR检测结果显示，与control组相比，si-circRNA组circRNA-32011表达水平下调至约42%，有效抑制其表达(P<0.01)(Fig 4A)。首先在生理条件下，向乳鼠原代心肌细胞中转染circRNA-32011的siRNA。通过MTT检测发现与NC组进行相比，敲减circRNA-32011心肌细胞活力下降(Fig 4B)。RT-PCR和Western blot结果显示，与NC组相比，正常水平下敲减circRNA-32011心肌细胞凋亡相关基因Bcl-2/Bax表达降低(P<0.05)(Fig 4C-D)。为进一步探究circRNA-32011功能，我们转染si-circRNA后予以ATO进行干预。MTT实验结果表明，与(ATO+NC)组，敲减circRNA-32011进一步加重ATO降低心肌细胞活力(P<0.01)(Fig 4E)。Western blot结果表明，与(ATO+NC)组相比，敲减circRNA-32011进一步降低Bcl-2/Bax表达水平(P<0.01)(Fig 4F)。以上结果表明，敲减circRNA-32011加重ATO诱导的心肌细胞凋亡。

3 讨论

应用ATO可对身体各个器官造成不同程度的损害，其中心脏毒性最为明显[8]。目前ATO产生心脏毒性的机制仍不明确，已有研究显示，ATO可诱导心肌细胞凋亡、阻断心肌细胞分化、诱导心肌细胞生长停滞以及延长心脏Q-T间隔[9]。

ATO可诱导心肌细胞凋亡，而金雀异黄素可抑制细胞内钙超载，下调p-JNK和p-p38-MAPK蛋白表达改善线粒体膜电位的损伤，从而抑制caspase-3活性，抑制ATO诱导的心肌细胞凋亡，发挥心脏保

Fig 4 ATO-induced apoptosis in cardiomyocytes promoted by knockdown circRNA-32011 )A:MRNA levels of circRNAs detected by RT-PCR,**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs NC.B:Cell viability detected by MTT assay,**P<0.01 vs control;#P<0.05 vs NC.C:MRNA levels of Bcl-2/Bax detected by RT-PCR,*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs NC.D:Protein levels of Bcl-2/Bax measured by Western blot,*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs NC.E:Cell viability detected by MTT assay,**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs ATO+NC.F:Protein levels of Bcl-2/Bax measured by Western blot,**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs ATO+NC.

护作用，该研究提示ATO诱导心肌细胞凋亡过程可调控[10]。Bao等[11]研究发现,应用0.1、0.5和1 μmol·L-1ATO可抑制人诱导多能干细胞 (hiPSCs)增殖，抑制心脏分化过程，在该研究中,TUNEL实验结果显示，在心脏分化过程中，ATO可引起细胞凋亡，且呈浓度依赖性。此外，ATO可引起DNA损伤，表现为γH2AX的上调，γH2AX是DNA双链断裂标记。与以上研究相符，本课题结果显示,ATO抑制心肌细胞活力，凋亡相关指标Bcl-2/Bax表达，提示ATO诱导心肌细胞凋亡。为改善ATO心脏毒性，扩展ATO临床应用，本研究进一步探究三氧化二砷诱导心肌细胞凋亡机制。

研究表明circRNAs参与调控多种疾病发生发展，包括心血管疾病[12]。多项研究显示,circRNAs可调控心肌细胞凋亡[10-11]，因此，探究circRNAs是否参与调控ATO诱导的心肌凋亡，对诊断和治疗 ATO造成的心肌损伤具有重要意义。本研究首先从缺血心肌组织circRNAs差异表达芯片，筛选3条差异低表达(具有潜在心脏保护功能)的circRNAs，通过RT-PCR实验检测ATO处理的心肌细胞中3条circRNAs的表达变化，其中circRNA-32011明显下调，提示其可能参与调控ATO诱导的心肌细胞凋亡过程。由于circRNAs通过外显子或内含子环化作用在3′和5′末端连接形成完整的环结构，因此它们不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定[13]。本研究中Sanger测序及核酸外切酶R实验结果显示circRNA-32011具环状结构。

本研究构建circRNA-32011过表达质粒，生理条件下，心肌细胞中转染circRNA-32011过表达质粒，PCR结果显示与对照组相比，转染组circRNA-32011表达升高。提示在心肌细胞中成功过表达circRNA-32011。随后，ATO加药组心肌细胞中转染circRNA-32011过表达质粒，结果显示过表达circRNA-32011明显抑制ATO诱导的心肌细胞存活率及Bcl-2/Bax下调，表明circRNA-32011可抑制ATO诱导的心肌细胞凋亡。本研究采用特异性siRNA敲减内源性circRNA-32011，在转染si-circRNA后给予ATO进行干预，结果显示，与ATO组相比，敲减circRNA-32011进一步降低细胞存活率及Bcl-2/Bax，表明敲减circRNA-32011加重ATO诱导的心肌细胞凋亡。

本研究结果显示，circRNA-32011参与调控ATO诱导的心肌细胞凋亡，但具体下游调控机制还有待进一步的研究。CircRNAs发挥功能的主要作用机制是作为miRNA分子海绵，通过ceRNA机制调控mRNA稳定性和翻译，例如circNCX1靶向结合miR-133a-3p促进心肌细胞凋亡[14]。此外，研究表明circRNAs可与蛋白直接结合，在癌症干细胞(CSC)中circZKSCAN1通过竞争性结合FMRP(一种RNA结合蛋白)抑制FMRP与β-catenin结合蛋白和凋亡调节蛋白1(CCAR1)mRNA结合，进而抑制Wnt信号通路[15]。

本研究仅在乳鼠原代心肌细胞离体水平验证circRNA-32011可参与调控ATO诱导的心肌细胞凋亡。后续实验需通过动物在体进一步验证circRNA-32011功能。同时，利用生物信息学预测circRNA-32011调控心肌细胞凋亡的下游靶点，明确circRNA-32011调控ATO诱导的心肌细胞凋亡的具体机制。

综上所述，本研究明确了circRNA-32011调控ATO诱导心肌细胞凋亡的作用。ATO处理的心肌细胞中circRNA-32011异常低表达，过表达circRNA-32011逆转由ATO诱导的心肌细胞凋亡，发挥心肌细胞保护功能。提示circRNA-32011可能成为预防和治疗ATO心脏毒性的新型指标和药物，为扩展ATO临床应用提供了理论基础，具有重要的临床治疗意义。