AKR1C1 在良性前列腺增生细胞系中的功能

叶林朋 吕 源 杨中华

1黄梅县人民医院泌尿外科 湖北 黄冈 435500；

2武汉大学中南医院泌尿外科 湖北 武汉 430071

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是导致中老年男性排尿障碍的常见泌尿系统疾病［1］，其以尿频、尿急、夜尿增多等膀胱刺激症状以及排尿时间延长、尿线变细、进行性排尿困难等尿路梗阻症状为主要临床表现，并可伴有小腹部坠胀感或腰骶痛等其他表现，严重时可引起急性尿潴留或上尿路病变等继发症［2］。前列腺与雄激素之间联系非常紧密［3］，雄激素作用是BPH 发生发展的必要条件。雄激素与前列腺细胞上的相应受体结合，通过抑制细胞凋亡及促进细胞增殖作用引起前列腺细胞的增殖凋亡失调，继而导致前列腺增生。双氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT）［4］虽然对前列腺的正常生长发育起促进作用，但同时也会导致前列腺增生等病理性改变。DHT 通过刺激间质组织并引发其细胞增殖，同时诱发上皮细胞发生分裂，促进BPH 的发生发展。

醛酮还原酶家族1 成员C1（aldoketo reductase family 1 member C1，AKR1C1）［5］基因属于醛酮还原酶超家族，该家族共有5 个家族成员，在人类类固醇代谢中有重要作用。AKR1C 家族成员包括AKR1C1、 AKR1C2、 AKR1C3、 AKR1C4 和AKR1D1，这些基因均位于10号染色体p14 上［6］。研究发现AKR1C 家族成员在不同肿瘤中有重要作用，并与BPH 等良性疾病密切相关［7］。AKR1C1 是前列腺细胞自身合成睾酮与DHT 的关键酶，AKRIC1 可使DHT 转化为3β⁃二醇，3β⁃二醇结合雄激素受体β 参与细胞的增殖和凋亡。但是关于AKR1C1 在BPH 中的作用尚不明确。有文献报道证实AKR1C1 在BPH 组织中异常高表达［8］，因此，本研究旨在明确AKR1C1 在前列腺细胞中的功能。

1 材料与方法

1.1 细胞培养人良性前列腺增生上皮细胞系BPH⁃1（资源编号BNCC339850）、人正常前列腺基质永生化细胞系 WPMY⁃1（资源编号BNCC100291）购于上海中科院细胞库。BPH⁃1 细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基（Gibco，澳大利亚）中培养，WPMY⁃1 细胞在含5%胎牛血清的DMEM 高糖培养基（Gibco，澳大利亚）中培养。所有细胞系均在37 ℃，95%空气和5%CO2的培养箱中培养。

1.2 转染siRNA 和转染试剂购自苏州吉玛基因股份有限公司，小干扰RNA 序列（5'—3'）如下：si⁃AKR1C1⁃1：AAGGAGCTTTCCGGACC；si⁃AKR1C1⁃2：GGGAACTTAGAGCAAGCC；si⁃AKR1C1⁃3：TTAACGAGATTACCGGC；si⁃con：GGAAGTCCCGATCTATACG。 细胞计数后接种于6 孔板，每孔密度约为106个。当6 孔板里的细胞汇合度达到30%～50%时更换新鲜培养基。根据试剂制造商提供的说明书配置转染体系后，室温孵育15～30 min，随后每孔加入200 µL 复合物，在37 ℃，95%空气和5% CO2的培养箱中继续培养6 h 后，再次更换新鲜培养基，继续培养48 h。

1.3 流式细胞学分析用预冷PBS 离心洗涤，收集106个细胞（含上清液中的细胞）。用双蒸水稀释5×Binding Buffer 为1×工作液，取500 µL 1×Bind⁃ing Buffer 重悬细胞，每管加入5 µL Annexin V⁃FITC 和10 µL PI（联科生物，杭州），轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5 min，用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。用预冷PBS 离心洗涤，收集106个细胞，加入1 mL DNA Staining solution 和10 µL Permea⁃bilization solution（联科生物，杭州），涡旋振荡5～10 s 混匀，室温避光孵育30 min，用流式细胞仪进行细胞周期分析。

1.4 细胞MTT 检测转染后48 h，收集细胞并计数，在96 孔板中每孔接种3 000～5 000 个细胞，每孔体积为200 µL。经过0、1、2、3 d 的培养后，每孔加入10 µL MTT 溶液/100 µL 培养基，在37 ℃，95%空气和5% CO2的培养箱中继续培养2 h 后在微平板阅读器（Thermo Scientific）上读取其在450 nm 处的吸光度。

1.5 RNA 提取和实时荧光定量PCR根据试剂制造商提供的说明书，利用Hipure Total RNA Mini Kit（Cat. R4111⁃03，Magen）提取细胞中的总RNA。实时定量PCR 采用Bio⁃Rad（美国）CFX96 体系进行。所有基因的表达水平由GAPDH 进行标准化。所有的样本均独立重复3 次（引物序列见表1）。

表1 用于PCR 的引物序列

1.6 免疫蛋白印迹分析将106个细胞于含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA（Sigma⁃Aldrich）中超声处理后，放置于冰上裂解30 min。12 000g离心15 min，收集上清。30 µg 总蛋白经10%十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶分离，用Bio⁃Rad 湿转移系统转移至PVDF 膜（Millipore，Billerica，MA，美国）。用含5%脱脂奶粉的TBST 溶液室温孵育2 h，4 ℃条件下一抗孵育过夜（主要抗体见表2）。用TBST 溶液洗涤3 次后，室温条件下二抗孵育2 h。再次TBST 洗涤3 次，用化学发光试剂盒检测所有反应抗原。所有蛋白的表达水平由GAPDH 进行标准化。所有的样本均独立重复3 次。

表2 用于Western Blot 的一抗

1.7 统计学分析数据值用均数±标准差表示。统 计 分 析 使 用SPSS 22.0（IBM，Armonk，NY，USA）软件，统计分析采用单因素方差分析。P<0.05 被认为具有统计学差异。

2 结果

2.1 AKR1C1 的敲减减缓了前列腺细胞的增殖水平为了建立AKR1C1 缺失的细胞模型，我们将3种不同的 AKR1C1 靶向特异性 siRNAs（si⁃AKR1C1s）转染到WPMY⁃1 和BPH⁃1 细 胞中，48 h 后RT⁃PCR（图1A、1B）结果分析提示，可以观察到si⁃AKR1C1⁃2 在两种细胞系中有着近乎80%的敲减效率，于是si⁃AKR1C1⁃2 被选择使用进行后续实验，相应的蛋白表达水平相一致（图1C、1D）。MTT 结果显示AKR1C1 的敲减在BPH⁃1 和WP⁃MY⁃1 细胞系中表现出时间依赖性的增殖活性下降（图1E、1F）。

图1 前列腺细胞系中敲减AKR1C1 的效率验证及对细胞增殖活性影响

2.2 AKR1C1 的敲减促进了前列腺细胞的凋亡水平，而对细胞周期无明显影响在细胞凋亡及周期的检测中我们观察到，AKR1C1 的敲减对BPH⁃1 和WPMY⁃1 细胞系的周期无明显影响（图2A、2B、2C），但可使BPH⁃1 和WPMY⁃1 细胞的凋亡率上升（图2D、2E、2F）。相应的周期蛋白CDK2 及CDK4在AKR1C1 敲减后无明显表达差异，反映凋亡水平的表达蛋白BAX 在AKR1C1 敲减后表达上调，而凋亡负相关蛋白Bcl⁃2 在AKR1C1 敲减后表达下调（图2G、2H）。

图2 前列腺细胞系中敲减AKR1C1 对细胞周期及凋亡的影响

2.3 AKR1C1 的过表达上调了前列腺细胞的增殖水平将质粒转染到BPH⁃1 和WPMY⁃1 细胞中过表 达AKR1C1，连 续 培 养48 h 后，AKR1C1 在mRNA 和蛋白质水平上均达到上调效果（图3A、3B、3C），以进行后续实验。 MTT 结果显示AKR1C1 的过表达在BPH⁃1 和WPMY⁃1 细胞系中表现出时间依赖性的增殖活性上调（图3D、3E）。

图3 前列腺细胞系中过表达AKR1C1 的效率验证及对细胞增殖活性影响

2.4 AKR1C1 的过表达抑制了前列腺细胞的凋亡水平，而对细胞周期无明显影响在细胞凋亡及周期的检测中观察到，AKR1C1 的过表达对BPH⁃1 和WPMY⁃1 细胞系的周期无明显影响（图4A、4B、4C），但可抑制BPH⁃1 和WPMY⁃1 细胞的凋亡（图4D、4E、4F）。相应的周期蛋白CDK2 及CDK4 在AKR1C1 过表达后无明显表达差异，反映凋亡水平的表达蛋白BAX 在AKR1C1 过表达后表达下降，而凋亡负相关蛋白Bcl⁃2 在AKR1C1 过表达后表达上调（图4G、4H）。

图4 前列腺细胞系中敲减AKR1C1 对细胞周期及凋亡的影响

3 讨论

人类前列腺对正常男性生殖是必不可少的，成熟腺体的生长和维持依赖于强效雄激素5α⁃二氢睾酮（DHT）［9］。雄激素作用是BPH 发生发展的必要条件。雄激素与前列腺细胞上的相应受体结合，通过抑制细胞凋亡及促进细胞增殖作用引起前列腺细胞的增殖凋亡失调，继而导致BPH［10］。DHT 作为雄激素的一种，其浓度在BPH 组织中比正常组织中明显增高，其与前列腺腺体内受体的亲和力更强。DHT 虽然对前列腺的正常生长发育起促进作用，但同时也会导致前列腺增生等病理性改变［11］。DHT 通过刺激间质组织并引发其细胞增殖，同时诱发上皮细胞发生分裂，促进BPH 的发生发展。雄激素的作用在前列腺中由负责DHT 的形成和消除的酶在预受体水平上调控，例如2，5α⁃还原酶和羟类固醇脱氢酶［9］，这些酶或核受体的失调可能导致雄激素依赖性疾病的发生。

本 研 究 对BPH⁃1 和WPMY⁃1 细 胞 系 中 的AKR1C1 基因进行敲减和过表达，以进一步验证AKR1C1 水平的变化对前列腺细胞的功能影响。结果表明，AKR1C1 的敲减减弱了前列腺细胞的增殖能力，加快了细胞的凋亡水平，而其过表达则对前列腺细胞的增殖水平发挥促进作用，同时在一定程度上抑制了细胞的凋亡发生，以上均表明AKR1C1 在前列腺细胞中是一个促进增殖、抑制凋亡的蛋白。但在细胞周期的检测中我们观察到，AKR1C1 水平的变化并未对前列腺细胞的细胞周期产生明显影响，这可能表明AKR1C1 在前列腺细胞中并不是一个周期相关的蛋白。

综上所述，良性前列腺增生中AKR1C1 的高水平表达，可促进前列腺细胞的增殖，抑制细胞的凋亡，从而在良性前列腺增生疾病的发生和发展中发挥作用。因此，针对AKR1C1 靶点，有可能成为良性前列腺增生的治疗新策略。