前列地尔通过下调TRIM8表达激活Nrf2/ARE通路抑制心肌缺血再灌注损伤

郑伟民，詹智晖，吴钟伟，刘超权，陈运起，李堪董

缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)是世界范围内主要的死亡原因之一，每年死亡率为2%～3%[1]。目前的医学干预措施包括经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)或冠状动脉旁路移植术，可改善心脏的血液供应[2]。然而，心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)引起的不可逆性损伤，在充分的血运重建后，可能作为心绞痛的症状出现。超过50%的IHD病人在PCI治疗后心绞痛症状复发，大多数病人在冠状动脉旁路移植术后10～15年都有心绞痛复发[3]。因此，需要开发新的治疗药物抑制心肌I/R损伤，以改善IHD的临床治疗现状。三结构域8(tripartite motif 8，TRIM8)是TRIM蛋白家族的成员之一。研究表明，TRIM8参与脑I/R损伤的发生发展，敲除TRIM8通过抑制炎症反应和细胞凋亡，对脑I/R损伤具有神经保护作用[4]。NFE2L2基因编码的核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是氧化还原敏感的主要转录因子，对解毒和抗氧化酶基因的表达是必不可少的[5]。已有研究表明，激活Nrf2/抗氧化元件(anti-oxidant element，ARE)通路可抑制缺氧/复氧(hypoxia-reperfusion，H/R)诱导的心肌细胞凋亡和活性氧(ROS)的产生[6]。前列地尔也称为前列腺素E1(prostaglandin E1，PGE1)，具有扩张血管、抑制血小板聚集的作用，可降低冠状动脉造影和PCI病人造影剂肾病的发生率[7]。已有研究表明，前列地尔在脂多糖诱导的心肌细胞损伤中发挥保护作用[8]。目前，关于前列地尔对心肌H/R损伤的作用机制尚不明确。本研究旨在探究前列地尔对心肌H/R损伤的作用及其对H/R损伤心肌细胞中TRIM8表达和Nrf2/ARE通路的影响，以期为明确前列地尔对心肌H/R损伤的作用机制及开发新的心肌H/R损伤治疗策略提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 12只新生无特定病原体(SPF)级SD大鼠，1～3日龄，8～15 g，雌雄不限；5-BrdU购自美国MedChemExpress；前列地尔购自北京泰德制药股份有限公司；TRIM8过表达载体(oe-TRIM8)及其阴性对照(oe-NC)购自武汉金开瑞生物工程有限公司；LipofectamineTM2000购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；CCK-8检测试剂盒购自日本同仁化学研究所；ROS检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；D-Hank′s液和膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自武汉普诺赛生命科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；α-actin、TRIM8和Nrf2抗体购自英国Abcam；醌氧化还原酶1(NQO-1)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology。

1.2 原代心肌细胞的分离和培养 参考文献[9]进行原代心肌细胞的分离和培养。乳鼠颈部脱臼致死，开胸取心脏。剔除周围结缔组织，D-Hank′s液漂洗心脏，将心脏剪碎后，加入0.25%胰酶液于37 ℃培养箱中消化心脏组织，每次消化5 min，共消化8次。每次消化后取上清液，加入等量含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培养基终止消化。细胞过200目细胞筛，800 r/min离心5 min收集细胞沉淀。含10% FBS的DMEM培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至培养皿中，细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中40 min，差速贴壁分离心肌细胞，去除成纤维细胞，重复该步骤1次。吸取未贴壁的细胞，接种于6孔板，加入0.1 mmol/L的5-BrdU抑制成纤维细胞生长，细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h。第3天去除5-BrdU继续培养，细胞每2 d更换1次新鲜培养基。

1.3 台盼蓝染色法检测心肌细胞存活率 差速贴壁分离心肌细胞后，用含10%FBS的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞密度至1×106个/mL，细胞悬液和台盼蓝溶液以9∶1比例混合均匀，细胞计数仪进行细胞计数。死细胞呈蓝色着染，活细胞无染色。细胞存活率=活细胞数/细胞总数×100%。

1.4 间接免疫荧光检测心肌细胞标志物α-actin表达 弃去心肌细胞旧培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，加入4%多聚甲醛室温固定细胞10 min。PBS清洗细胞，加入0.1%TritonX-100穿透15 min；PBS清洗细胞，5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30 min。加入α-actin抗体(1∶200)4 ℃条件下孵育过夜；PBS清洗细胞，加入荧光二抗(1∶500)室温孵育1 h；PBS清洗细胞，4′-6-二胱基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min；PBS清洗细胞，荧光显微镜观察。α-actin阳性呈绿色荧光，DAPI染核呈蓝色荧光。

1.5 流式细胞术检测心肌细胞标志物α-actin阳性表达率 收集心肌细胞，PBS清洗细胞后，加入4%多聚甲醛室温固定细胞10 min。PBS清洗细胞，加入0.1% TritonX-100穿透15 min；PBS清洗细胞，5%BSA室温封闭30 min。加入α-actin抗体(1∶200)4 ℃条件下孵育2 h；PBS清洗细胞，加入荧光二抗(1∶500)4 ℃条件下孵育30 min；PBS清洗并重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1.6 心肌细胞分组给药及H/R处理 将对数期生长的心肌细胞接种于6孔板，每孔细胞量为5×105个。细胞置于37 ℃、5%CO2和95%O2培养箱中培养24 h后，将其随机分为对照组、H/R组、前列地尔组(加入40 μg/L前列地尔)、前列地尔+oe-NC组(加入40 μg/L前列地尔和转染oe-NC)和前列地尔+oe-TRIM8组(加入40 μg/L前列地尔和转染oe-TRIM8)。根据分组，按照LipofectamineTM2000说明书所示，进行oe-NC和oe-TRIM8的转染。细胞继续培养48 h后，按照分组向细胞中添加前列地尔，细胞继续培养24 h。除对照组外，其余组根据参考文献[10]所示，进行H/R处理。将细胞培养基更换为无血清和无糖的DMEM培养基，在37 ℃、94%N2、5%CO2和1%O2培养箱中培养4 h后，将细胞培养基更换为含10% FBS的DMEM培养基，细胞置于37 ℃、5%CO2和95%O2培养箱中培养6 h后，进行后续实验操作。

1.7 CCK-8检测细胞增殖

1.7.1 前列地尔给药浓度测定 将对数期生长的心肌细胞接种于96孔中，每孔细胞数量为5×103个。细胞置于37 ℃、5%CO2和95%O2培养箱中培养24 h 后，将细胞随机分为0 μg/L组、5 μg/L组、10 μg/L组、20 μg/L组、40 μg/L组、80 μg/L组和160 μg/L组，按照分组，向细胞中添加不同浓度前列地尔，细胞继续培养24 h后，向每孔细胞中加入10 μL CCK-8溶液，将96孔板置于37 ℃培养箱中孵育4 h，用酶标仪测定各孔在450 nm处的光密度(OD)值。细胞增殖(%)=不同浓度给药组OD450/0 μg/L组OD450×100%。

1.7.2 各组细胞活力检测 将对数期生长的心肌细胞接种于96孔中，每孔细胞数量为5×103个。细胞置于37 ℃、5%CO2和95%O2培养箱中培养24 h 后，参照方法1.6对心肌细胞进行处理。向每孔细胞中加入10 μL CCK-8溶液，将96孔板置于37 ℃培养箱中孵育4 h，用酶标仪测定各孔在450 nm处的光密度(OD)值。细胞增殖(%)=处理组OD450/对照组OD450×100%，或者是细胞增殖(%)=处理组OD450/H/R组OD450×100%。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡 按照方法1.6所示，对心肌细胞进行分组给药及H/R处理。收集心肌细胞，预冷PBS清洗细胞。向细胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重悬细胞，调整细胞浓度至1×106个/mL。取100 μL细胞悬液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，轻轻混匀后，室温避光孵育15 min。随后，加入400 μL 1×Binding buffer工作液，混匀后，立即用流式细胞仪检测。

1.9 流式细胞术检测ROS产生 按照方法1.6所示，对心肌细胞进行分组处理。收集心肌细胞，加入1 mL 10 μmol/L的DCFH-DA重悬细胞。细胞悬液置于37 ℃培养箱内孵育20 min。用无血清DMEM培养基清洗细胞后，加入PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1.10 蛋白质印迹法(Western Blot)检测TRIM8、Nrf2和NQO-1蛋白表达 按照方法1.6所示，对心肌细胞进行分组处理。收集心肌细胞，加入蛋白裂解液冰上裂解细胞30 min。4 ℃、12 000 r/min离心30 min，收集上清液。按照BCA试剂盒说明书所示进行上清液蛋白浓度的检测。取30 μg蛋白加入凝胶中，进行电泳操作。电泳结束后，应用湿转法将凝胶中的蛋白质转印至PVDF膜上。5%BSA室温下封闭PVDF膜3 h。随后加入TRIM8抗体(1∶2 000)、Nrf2抗体(1∶2 000)、NQO-1抗体(1∶1 000)和GAPDH抗体(1∶5 000)，4 ℃条件下孵育过夜。特异性二抗(1∶5 000)室温孵育1 h。向PVDF膜均匀滴加电化学发光(ECL)试剂，暗室曝光。Image J软件进行蛋白条带的灰度分析。

2 结 果

2.1 原代乳鼠心肌细胞的鉴定 台盼蓝染色结果显示，心肌细胞存活率为(95.67±2.13)%。间接免疫荧光和流式细胞术结果显示，心肌细胞中α-actin呈阳性表达。详见图1。

图1 原代乳鼠心肌细胞的鉴定

2.2 前列地尔对H/R心肌细胞增殖和凋亡的影响 CCK-8检测前列地尔对心肌细胞的安全浓度，结果显示，前列地尔在80 μg/L和160 μg/L浓度下可显著抑制心肌细胞增殖(P<0.05)，因此，后续实验中，前列地尔使用浓度为40 μg/L。CCK-8检测前列地尔对H/R心肌细胞增殖的影响，结果显示，与对照组相比，H/R组心肌细胞增殖能力明显降低(P<0.05)；与H/R组相比，前列地尔组心肌细胞增殖能力明显升高(P<0.05)。流式细胞术检测心肌细胞凋亡结果显示，与对照组相比，H/R组心肌细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与H/R组相比，前列地尔组心肌细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。详见图2。

与0 μg/L组比较，＊P<0.05；与对照组比较，#P<0.05；与H/R组比较，&P<0.05。

2.3 前列地尔对H/R心肌细胞ROS产生的影响 流式细胞术检测前列地尔对H/R心肌细胞ROS产生的影响，结果显示，与对照组相比，H/R组心肌细胞中ROS+细胞率明显升高(P<0.05)；与H/R组相比，前列地尔组心肌细胞中ROS+细胞率明显降低(P<0.05)。详见图3。

与对照组比较，＊P<0.05；与H/R组比较，#P<0.05。

2.4 前列地尔对TRIM8表达和Nrf2/ARE通路的影响 Western Blot检测前列地尔对TRIM8表达和Nrf2/ARE通路的影响，结果显示，与对照组相比，H/R组心肌细胞中TRIM8、Nrf2和NQO-1蛋白表达明显升高(P<0.05)；与H/R组相比，前列地尔组心肌细胞中TRIM8蛋白表达明显降低，Nrf2和NQO-1蛋白表达明显升高(P<0.05)。详见图4。

与对照组比较，＊P<0.05；与H/R组比较，#P<0.05。

2.5 过表达TRIM8部分逆转前列地尔对H/R心肌细胞增殖和凋亡的影响 Western Blot检测心肌细胞TRIM8的表达，结果显示，与H/R组相比，前列地尔组心肌细胞中TRIM8蛋白表达明显降低(P<0.05)；前列地尔组和前列地尔+oe-NC组心肌细胞中TRIM8蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)；与前列地尔+oe-NC组相比，前列地尔+oe-TRIM8组心肌细胞中TRIM8蛋白表达明显升高(P<0.05)。详见图5。

与H/R组比较，＊P<0.05；与前列地尔+oe-NC组比较，#P<0.05。

CCK-8检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，与H/R组相比，前列地尔组心肌细胞增殖能力明显升高(P<0.05)，细胞凋亡率明显降低(P<0.05)；前列地尔组和前列地尔+oe-NC组心肌细胞增殖和凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)；与前列地尔+oe-NC组相比，前列地尔+oe-TRIM8组心肌细胞增殖能力明显降低(P<0.05)，细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。详见图6。

2.6 过表达TRIM8部分逆转前列地尔对H/R心肌细胞ROS产生的影响 流式细胞术检测心肌细胞ROS的产生，结果显示，与H/R组相比，前列地尔组心肌细胞中ROS+细胞率明显降低(P<0.05)；前列地尔组和前列地尔+oe-NC组ROS+细胞率比较差异无统计学意义(P>0.05)；与前列地尔+oe-NC组相比，前列地尔+oe-TRIM8组心肌细胞中ROS+细胞率明显升高(P<0.05)。详见图7。

与H/R组比较，＊P<0.05；与前列地尔+oe-NC组比较，#P<0.05。

与H/R组比较，＊P<0.05；与前列地尔+oe-NC组比较，#P<0.05。

2.7 过表达TRIM8部分逆转前列地尔对H/R心肌细胞Nrf2/ARE通路的影响 Western Blot检测心肌细胞中Nrf2和NQO-1的表达，结果显示，与H/R组相比，前列地尔组心肌细胞中Nrf2和NQO-1蛋白表达比较明显升高(P<0.05)；前列地尔组和前列地尔+oe-NC组心肌细胞中Nrf2和NQO-1蛋白表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；与前列地尔+oe-NC组相比，前列地尔+oe-TRIM8组心肌细胞中Nrf2和NQO-1蛋白表达明显降低(P<0.05)。详见图8。

与H/R组比较，＊P<0.05；与前列地尔+oe-NC组比较，#P<0.05。

3 讨 论

H/R是许多病理生理过程中细胞损伤和组织损伤的重要原因，包括缺血综合征、I/R和脑卒中[11]。早期再灌注治疗是目前急性心肌梗死病人的标准治疗方法。然而，心肌I/R会进一步加剧心肌细胞损伤，从而导致心脏疾病[12]。因此，如何减轻心肌I/R损伤是IHD治疗的关键。

心肌I/R损伤是一个非常复杂的病理生理过程，包括离子蓄积、线粒体功能障碍、ROS形成、氧化应激和炎症的激活以及细胞凋亡等[13]。靶向抑制心肌细胞凋亡和ROS的产生，对再灌注损伤具有保护作用[14]。前列地尔是广泛存在于生物体内的生物活性物质，具有改善血流动力学和血液流变学、降低血脂和血黏度、改善微循环，等作用[14]。已有证据表明，前列地尔可改善自主循环，恢复大鼠肾微血管内皮细胞H/R损伤，抑制炎症反应[15]。此外，在肝脏I/R损伤的相关研究中，前列地尔也发挥着保护作用。前列地尔通过改善肝脏微循环，减少氧化应激损伤，减少肝内中性粒细胞浸润和肝细胞凋亡，保护肝脏免受I/R损伤[16]。目前，已有相关的研究证明，前列地尔可明显抑制H/R损伤诱导的心肌细胞毒作用和细胞凋亡，在心肌细胞H/R损伤中发挥保护作用[17]。本研究以原代乳鼠心肌细胞为研究对象，探讨前列地尔对H/R处理的心肌细胞的影响，结果显示，H/R可诱导心肌细胞凋亡和ROS产生，抑制细胞增殖。而前列地尔给药处理可明显抑制H/R处理的心肌细胞凋亡和ROS产生，促进细胞增殖。本研究结果表明，前列地尔在心肌H/R损伤中发挥保护作用。

TRIM8基因位于染色体10q24.3上，广泛表达于肺、肠、肾、脑和胎盘等多种组织中。TRIM8参与细胞存活、分化、炎症、先天免疫反应、细胞凋亡等多种生物学过程[18]。已有研究表明，TRIM8参与多种组织I/R损伤过程，例如，肝脏I/R损伤后，TRIM8在肝脏中的表达上调。TRIM8基因敲除可减轻I/R引起的肝细胞损伤，抑制肝脏炎症反应和细胞凋亡[19]。TRIM8可促进心肌I/R损伤。在H/R处理的心肌细胞中，TRIM8表达上调。TRIM8基因敲除可以提高H/R刺激的心肌细胞的存活率。此外，TRIM8基因敲除抑制了ROS的产生，提高了超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的水平，抑制了心肌细胞凋亡[20]。本研究结果显示，H/R可诱导心肌细胞中TRIM8蛋白表达，而前列地尔给药处理可抑制H/R损伤心肌细胞中TRIM8蛋白表达。进一步实验结果表明，过表达TRIM8可部分逆转前列地尔对H/R损伤心肌细胞的保护作用，促进细胞凋亡和ROS产生，抑制细胞增殖。本研究结果表明，前列地尔通过上调TRIM8表达，在心肌H/R损伤中发挥保护作用。

Nrf2是保护哺乳动物细胞免受氧化和亲电应激的最重要的转录因子之一。在氧化应激条件下，Nrf2从Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch sample related protein-1，Keap1)复合体中释放出来，转移到细胞核，诱导一系列抗氧化和解毒基因的转录，最终导致防御系统的激活[21]。研究表明，H/R可诱导肝细胞中Nrf2/ARE信号通路的激活，而灯盏乙素通过进一步激活Nrf2/ARE信号通路抑制细胞凋亡和氧化应激，减轻肝细胞H/R损伤[22]。目前的证据显示，在缺氧-葡萄糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation，OGD/R)处理的神经元中，TRIM8的表达上调，Nrf2/ARE通路被激活。敲除TRIM8可以提高OGD/R暴露的神经元的存活率，减少细胞的凋亡和ROS的产生。此外，敲除TRIM8还进一步激活了Nrf2/ARE通路，沉默Nrf2明显减弱了敲低TRIM8介导的神经保护作用[23]。此外，已有相关研究证明，前列地尔通过激活Nrf2信号通路，抑制氧化应激，减轻心肌细胞凋亡，在冠状动脉微栓塞术所致心肌损伤中发挥保护作用[24]。本研究结果显示，H/R可诱导心肌细胞中Nrf2和通路下游因子NQO-1的表达上调，而前列地尔可进一步上调H/R处理的心肌细胞中Nrf2和NQO-1的表达蛋白。此外，过表达TRIM8可部分逆转前列地尔对H/R处理的心肌细胞Nrf2/ARE通路的影响，下调Nrf2和NQO-1蛋白表达。本研究结果表明，前列地尔可能通过下调TRIM8的表达激活Nrf2/ARE通路，在心肌H/R损伤中发挥保护作用。

综上所述，前列地尔可能通过下调TRIM8的表达激活Nrf2/ARE通路，抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡和ROS产生，促进心肌细胞增殖，从而在心肌H/R损伤中发挥保护作用。本研究为明确前列地尔对心肌I/R损伤的作用机制及开发新的心肌I/R损伤治疗策略提供了新的依据。