核糖核酸酶A家族成员2基因与胶质瘤免疫浸润水平及临床预后的关系分析△

于海明，卢武，李玉姬，张思也

湖南省人民医院重症医学科，长沙 410000

神经胶质瘤是中枢神经系统（central nervous system，CNS）最致命的原发性脑肿瘤。美国约有30%的CNS肿瘤被诊断为神经胶质瘤[1]，其中，恶性肿瘤占81%[2]。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）根据组织学特征将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级[3]。弥漫性低级别（WHOⅠ～Ⅱ级）胶质瘤称为低级别胶质瘤（low-grade glioma，LGG）[4]。由于其增殖速度快和高侵袭性，这些LGG将在几个月内发展成胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）（WHOⅢ～Ⅳ级）[5]。GBM是最常见的恶性胶质瘤，临床预后差，很少患者生存时间超过14个月[6]。因此，研发帮助判断胶质瘤临床预后的生物标志物是非常必要的。核糖核酸酶A家族成员2（ribonuclease A family member 2，RNASE2）是免疫系统的重要调控因子，是多种肿瘤的预后标志物[7-9]，但其在胶质瘤中与免疫浸润及预后的关系仍未有研究。本研究通过生物信息学分析RNASE2基因在胶质瘤组织与正常组织中的表达差异，并评估其与胶质瘤预后、免疫浸润水平的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 RNASE2基因的筛选过程

下载癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atla，TCGA）数据库中胶质瘤组织测序数据163个和脑组织测序数据44个，进行差异表达基因分析，得到7649个差异表达的基因（P＜0.05）；根据预后数据进行生存分析，取差异最显著的前500个预后基因（P＜0.05）。免疫基因来自IMMPORT数据库（https://www.immport.org/shared/genelists）中的细胞因子，共456个。三者采用韦恩在线分析（http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn）取交集。

1.2 RNASE2基因的表达水平分析

RNASE2基因在中国胶质瘤基因组图谱（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）和 TCGA 数据库泛癌中的表达采用肿瘤免疫评估资源（Tumor Immune Estimation Resource，TIMER）数据库（http://timer.comp-genomics.org/）和UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）进 行 分 析 。RNASE2基因在TCGA数据库中胶质瘤组织和脑组织中的mRNA表达量及其与预后的分析均应用基因表达谱动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn/about.html）软件进行分析。RNASE2基因在CGGA数据库中GMB和脑组织中的表达量分析采用数据库自带软件（http://www.cgga.org.cn/）进行分析。

1.3 RNASE2与免疫浸润的关系分析

RNASE2基因表达与大量免疫浸润细胞的相关性分析应用TIMER2.0数据库基因模块进行分析。

1.4 RNASE2及相关基因的京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）及基因本体论（gene ontology，GO）分析

采用Linkedomics软件（http://www.linkedomics.org/admin.php）中的Pearson相关分析法对TCGA数据库中胶质瘤（n=489）与RNASE2基因转录水平的相关性进行分析，并采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）进行GO功能富集分析及KEGG信号通路分析。

1.5 统计学分析

采用TCGA、CGGA、TIMER、UALCAN、GEPIA、Linkedomics等软件分析统计数据。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNASE2基因在胶质瘤中的表达水平

首先将胶质瘤表达差异显著基因（n=7649）、预后差异显著基因（n=500）、免疫细胞因子（n=456）取交集，得到7个交集基因，选择RNASE2作为后续研究对象。采用TIMER分析RNASE2在TCGA数据库泛癌中的表达，结果显示RNASE2在胶质瘤中表达较高（P＜0.001）（图1）。GEPIA分析显示，RNASE2基因在GMB和LGG中的表达水平均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图2）。UALCAN分析显示，RNASE2基因在GMB中的表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.001）（图3）。

图1 RNASE2在TCGA数据库泛癌中的表达

图2 GEPIA分析RNASE2基因在GMB、LGG及相应癌旁组织中表达水平的比较

图3 UALCAN分析RNASE2基因在GMB（n=156）及癌旁组织（n=5）中表达水平的比较

2.2 RNASE2表达与临床特征的关系

CGGA分析显示，RNASE2基因表达水平在WHOⅡ级、WHOⅢ级、WHOⅣ级胶质瘤中依次递增，差异有统计学意义（P＜0.001）（图4）；此外，RNASE2基因在复发胶质瘤中的表达水平明显高于原位胶质瘤，差异有统计学意义（P＜0.01）（图5）。

图4 CGGA分析RNASE2基因在不同WHO分级胶质瘤中的表达水平比较

图5 CGGA分析RNASE2基因在复发及原位胶质瘤中的表达水平比较

2.3 RNASE2表达与预后的关系

采用GEPIA2与CGGA分析RNASE2与预后的关系，结果显示，RNASE2低表达的GMB和LGG患者生存情况均明显优于RNASE2高表达的GMB和LGG患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（图6、图7）

图6 RNASE2低表达（n=65）与高表达（n=81）GMB患者的生存曲线

图7 RNASE2低表达（n=257）与高表达（n=257）LGG患者的生存曲线

2.4 RNASE2表达与免疫浸润的关系

RNASE2mRNA表达水平与CD8+T细胞呈负相关，与调节性T细胞呈正相关（P＜0.05）。（图8）

图8 RNASE2 mRNA表达与免疫浸润的相关性

2.5 RNASE2的基因富集分析

使用Linkedomics的LinkFinder模块分析TCGA数据库中胶质瘤患者的mRNA测序数据。结果显示，6235个基因与RNASE2呈负相关，5807个基因与RNASE2呈正相关。与RNASE2相关的前50位显著正性基因和前50位显著负性基因详见图9、图10。RNASE2与免疫基因Toll样受体1（Toll-like receptor 1，TLR1）呈正相关（r=0.773，P＜0.001）；RNASE2与ARVCFδ连环蛋白家族成员（ARVCFdeltacateninfamilymember，ARVCF）呈负相关（r=-0.471，P＜0.001）。

图9 与RNASE2相关的前50位显著正性基因表达热图

图10 与RNASE2相关的前50位显著负性基因表达热图

此外，通过GSEA进行KEGG通路分析，结果显示，与RNASE2相关的差异表达基因主要富集在免疫（Fc γ介导的吞噬作用）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路等中（图11）。GO分析结果与KEGG结果类似，RNASE2差异表达基因主要富集在免疫、炎症[急性炎症反应、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）生成]相关的生物过程（嗜中性粒细胞介导的免疫）和分子功能（胶原黏附、细胞因子受体活性）。为了进一步研究RNASE2在胶质瘤中可能的分子机制，利用Linkedomics对miRNA进行富集分析，结果显示RNASE2与（CAGCAGG）miRNA-370相关（图12）。

图11 GSEA分析RNASE2差异表达基因KEGG富集通路

图12 RNASE2的miRNA靶基因分析

3 讨论

目前，大多数胶质瘤患者的预后很差，即使采用综合治疗策略。胶质瘤的治疗耐药性已被广泛报道，与其独特的代谢机制和周围复杂的免疫抑制微环境密切相关[10-11]。因此，迫切需要探索可靠的预后生物标志物和个性化治疗策略。本研究发现，RNASE2表达在胶质瘤中显著增加，且与预后、复发有关。RNASE2可作为评价胶质瘤预后与复发的潜在标志物。

RNASE2作为核糖核酸酶A家族的一员，可以作为细胞因子参与免疫及肿瘤的预后[7,12-13]。Ostendorf等[13]的一项研究指出，Toll样受体8对合成细菌和原生动物RNA的免疫传感需要RNASET2和RNASE2的协调处理。在胃癌中，RNASE2与预后呈正相关，可作为潜在的评估胃癌预后及免疫浸润的标志物[7]。RNASE2还被证明为肺动脉高压及免疫浸润的标志物[14]。在肾透明细胞癌中，RNASE2与预后相关[15]。在另一项研究中，RNASE2可作为肾透明细胞癌预后的评价指标[9]。上述研究结论进一步佐证了RNASE2作为胶质瘤预后的标志物。

免疫浸润会导致胶质瘤中免疫微环境破坏，促进免疫逃逸的发生，因此，本研究评估RNASE2水平是否与胶质瘤的免疫浸润相关。调节性T细胞是CD4+T细胞的一个亚群，在胶质瘤中发挥促进肿瘤免疫逃逸的作用。随着胶质瘤恶性程度的增加，调节性T细胞比例增加[16]。多项研究说明调节性T细胞的高表达预示不良预后[17-18]。在本研究中，RNASE2基因的表达与调节性T细胞比例呈正相关，RNASE2低表达时，调节性T细胞比例低，预后更好（未提供）。本研究还发现RNASE2的表达与CD8+T细胞呈负相关。CD8+T细胞可分化为细胞毒性T细胞，抵抗外来病原体的入侵[19]。Kane等[20]证明CD8+T细胞介导的免疫编辑抑制小鼠胶质瘤基因组进化和免疫逃逸。

此外，对RNASE2的相关性基因分析发现，RNASE2与ARVCF基因表达呈负相关，与TLR1表达呈正相关。ARVCF表达下调时可抑制p53诱导的肿瘤细胞凋亡[21]。TLR1能够调节脑肿瘤微环境中的免疫反应[22]。为探讨RNASE2影响患者生存的可能机制，本研究对RNASE2差异表达基因进行了GO和KEGG富集分析，结果提示存在多种免疫相关通路。此外，GSEA富集分析进一步揭示了多种免疫相关功能和途径的富集。因此，推测RNASE2可能通过调节肿瘤免疫发挥促癌作用，如调节性T细胞、CD8+T细胞介导的免疫等，这在之前的研究中没有发现。

本研究发现了一个新的胶质瘤预后基因RNASE2，它也与免疫密切相关。这一结果在以往国内外研究中未见报道，因此本研究可能会影响胶质瘤未来的诊断和治疗。然而，本研究也有一些局限性。本研究未对RNASE2在胶质瘤细胞中的功能和潜在机制进行评估。此外，RNASE2与肿瘤免疫微环境之间的关系仍有待进一步验证。最后，RNASE2在一些特殊类型的胶质瘤（如弥漫性中线胶质瘤）中的作用仍有待进一步讨论。