复发胶质瘤组织中miRNA-200c的表达 及作用机制研究

恒聪 李镇宇 邓敏峰 曹志恺

【摘要】 目的：探討各级别及复发胶质瘤中miRNA-200c（miR-200c）的表达及可能机制。方法：收集本院收治的43例胶质瘤手术患者肿瘤切除标本，按照组织学分级不同将43例胶质瘤手术患者分为低级别胶质瘤组15例、高级别胶质瘤组22例、复发胶质瘤组6例，另选取10例正常脑组织标本为对照组。使用RT-PCR检测各级别初发胶质瘤及复发胶质瘤患者肿瘤组织中miR-200c的表达水平，通过Western blotting检测肿瘤干性指标（CD133、Nestin）及上皮间充质转化（EMT）标志物（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）在各组织中的表达。结果：各组miR-200c表达水平随着胶质瘤级别升高逐渐降低，两两组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）;各组Nestin表达水平随着胶质瘤级别升高逐渐升高，E-cadherin表达水平随着胶质瘤级别升高逐渐降低，两两组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）;高级别胶质瘤组、复发胶质瘤组CD133表达水平均较对照组、低级别胶质瘤组显著升高（P<0.05）;高级别胶质瘤组、复发胶质瘤组N-cadherin、Vimentin表达水平均较对照组显著升高（P<0.05），且复发胶质瘤组N-cadherin、Vimentin表达水平均较低级别胶质瘤组、高级别胶质瘤组显著升高（P<0.05）。结论：miR-200c在复发及高级别胶质瘤中表达下降，其缺失可能诱导EMT使肿瘤干性增加，可作为高级别及复发胶质瘤治疗的潜在靶点。

【关键词】 miR-200c 复发胶质瘤 上皮间充质转化 胶质瘤肿瘤干细胞

[Abstract] Objective： To investigate the expression and possible mechanism of miRNA-200c （miR-200c） in different grades of glioma and recurrent glioma. Method： The tumor resection specimens of 43 patients with glioma were collected， according to the histological classification， 43 patients were divided into low-grade glioma group （15 cases）， high-grade glioma group （22 cases） and recurrent glioma group （6 cases）， another 10 normal brain tissues were selected as the control group. RT-PCR was used to detect the expression of miR-200c in primary and recurrent glioma， Western blotting was used to detect the expression of tumor dryness index （CD133， Nestin） and epithelial mesenchymal transition （EMT） markers （E-cadherin， N-cadherin， Vimentin） in various tissues. Result： The miR-200c expression level of each group decreased with the increase of glioma grade， the differences between the two groups were statistically significant （P<0.05）. The Nestin expression level of each group increased with the increase of glioma grade， the E-cadherin expression level of each group decreased with the increase of glioma grade， the differences between the two groups were statistically significant （P<0.05）. The expression level of CD133 in high-grade glioma group and recurrent glioma group were significantly higher than those in control group and low-grade glioma group （P<0.05）. The expression levels of N-cadherin and Vimentin in high-grade glioma group and recurrent glioma group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）， and the expression levels of N-cadherin and Vimentin in the recurrent glioma group were significantly higher than those in the low-grade glioma group and the high-grade glioma group （P<0.05）. Conclusion： The expression of miR-200c decreased in recurrent and high-grade glioma， and the absence of miR-200c may induce EMT to increase tumor dryness， which may be a potential target for the treatment of high-grade and recurrent glioma.

神经胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，具有发病率、致死率高的特点，其中高级别胶质瘤患者的平均生存期仅为12～15个月[1-2]。目前胶质瘤复发的机制仍不明确，有学者认为目前的常规治疗并未能有效地清除胶质瘤肿瘤干细胞（glioma stem cells，GSCs），所以复发也就在所难免[3]。有研究证实，肿瘤干细胞和上皮细胞间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）之间有密切联系[4-5]，而MicroRNA（miR）-200c是调节肿瘤干细胞及肿瘤细胞EMT过程的重要分子[6]。尽管miR-200c在各类肿瘤中均有不同程度的改变，其是否参与胶质瘤的复发仍需要进一步探讨。该研究采用RT-PCR方法检测miR-200c在各级别及复发胶质瘤中的表达情况，并通过Western blotting分析EMT相关分子（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）及肿瘤干性相关分子（NESTIN、CD133）在各组织样本中表达情况，探讨miR-200c在复发胶质瘤发放发展中的作用，为复发胶质瘤的诊治提供前期基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源及分组 收集2017年1月-2019年12月本院收治的43例胶质瘤手术患者肿瘤切除标本，男28例、女15例;年龄<50岁24例、年龄≥50岁19例;肿瘤直径<5 cm 16例、腫瘤直径≥5 cm 27例;根据WHO 2007年中枢神经系统肿瘤分类标准进行组织学分级：初发患者中Ⅰ级7例、Ⅱ级8例、Ⅲ级13例、Ⅳ级9例，复发胶质瘤为二次及多次手术患者6例（病理均为WHO Ⅳ级）。纳入标准：所有初发患者术前均未进行放化疗;所有患者术后均行同步放化疗（同步放化疗采用直线加速器放疗，根据头颅MRI定位，采用局部扩大放疗，总剂量60 Gy，分30次，共6周），口服替莫唑胺75 ms/（m2·d），共42 d。排除标准：复发胶质瘤术后未进行放化疗及术后病理分级为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的不纳入组。另选取同期10例正常脑组织标本为对照组，均取自同期因颅脑损伤或脑出血需行内减压术的患者，术后病理检查证实均为正常脑组织。按照组织学分级不同将43例胶质瘤手术患者分为低级别胶质瘤组（WHO-Ⅰ/Ⅱ级）15例、高级别胶质瘤组（WHO-Ⅲ/Ⅳ级）22例、复发胶质瘤组（WHO-Ⅳ级）6例。该研究获得广州市第一人民医院伦理委员会同意及患者家属签字认可，操作符合临床试验伦理规范。

1.2 RT-PCR法检测各组miR-200c 常规Trizol试剂抽提总RNA，无酶水溶解沉淀。紫外分光光度计测定RNA提取液的A260及A280吸光度值，检测RNA纯度和浓度。逆转录反应按转录miRNA逆转录试剂盒（上海吉玛生物技术有限公司）说明书进行。反应体系：5×RT缓冲液4 μL、1 μmol/L miRNA特异性RT引物1.2 μL、25 mmol/L镁离子3 μL、10 mmol/L dNTP 0.75 μL、40 U/μL RNA酶抑制剂0.25 μL、200 U/μL MMLV逆转录酶0.2 μL、RNA 1 μg，用无酶水补至20 μL。反应条件：25 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。采用SYBR方法，应用Biorad公司的定量PCR仪IQ5进行定量PCR反应，U6作为内对照。反应体系：2×PCR缓冲液10 μL、5 μmol/L miRNA特异性PCR引物0.4 μL、RT产物1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、无酶水加至20 μL。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s、62 ℃ 40 s，共40个循环。

miR-200c的相对表达量通过公式2-△Ct计算，其中，△Ct=miR-200c平均Ct值-U6平均Ct值。

1.3 Western blotting检测各组相关分子表达情

况 裂解液冰上裂解各组组织提取总蛋白，测定蛋白浓度，每孔上样量为40 μg。按SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明配置10%分离胶，电泳液，140 V电压电泳1.5 h。按分子量切取相应目的条带，280 MA湿转80 min。封闭液（用1×TBST稀释的5% BSA）封闭1 h。加入兔抗人Nestin（1︰1 000）、CD133（1︰1 000）、E-cadherin（1︰1 000）、N-cadherin（1︰1 000），鼠抗人Vimentin（1︰100）、β-Actin一抗（1︰500），杂交袋4 ℃孵育过夜。1×TBST洗膜3次，5 min/次。加入山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗（1︰10 000），室温孵育1 h。1×TBST洗膜3次，5 min/次。ECL化学发光法曝光显影。以image J分析条带的灰度值。所需抗体均采购自Abcam公司。

1.4 统计学处理 使用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验或Dunnetts T3检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料比较 各组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。

2.2 各组miR-200c表达比较 检测结果显示，对照组、低级别胶质瘤组、高级别胶质瘤组、复发胶质瘤组miR-200c表达水平分别为（12.327±1.737）、（7.998±0.978）、（1.720±0.315）、（1.279±0.301），组间比较差异有统计学意义（F=371.890，P=0.000），且各组miR-200c表达水平随着胶质瘤级别升高逐渐降低，两两组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.3 各组肿瘤干性指标表达比较 Werstern blotting法检测结果显示，各组间CD133、Nestin表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;其中高级别胶质瘤组、复发胶质瘤组CD133表达水平均较对照组、低级别胶质瘤组显著升高，且复发胶质瘤组CD133表达水平较高级别胶质瘤组显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）;各组Nestin表达水平随着胶质瘤级别升高逐渐升高，两两组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2、图2。

2.4 各组EMT相关分子表达比较 各组N-cadherin、E-cadherin、Vimentin表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;其中高级别胶质瘤组、复发胶质瘤组N-cadherin、Vimentin表达水平均较对照组显著升高（P<0.05），且复发胶质瘤组N-cadherin、Vimentin表达水平均较低级别胶质瘤组、高级别胶质瘤组显著升高（P<0.05）;各组E-cadherin表达水平随着胶质瘤级别升高逐渐降低，两两组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3、图3。

3 讨论

胶质瘤是成人常见的颅内肿瘤，其中恶性程度高的胶质瘤侵袭性强，手术难以完全切除，术后复发率高，预后差[7]。而手术后放、化疗等序贯治疗还是难以避免胶质瘤的复发，这和肿瘤干细胞的存在有一定的关系。肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织或者肿瘤转移灶中存在極少且具有无限自我更新能力并可导致肿瘤发生的细胞-肿瘤干细胞样细胞（cancer stem like cells，CSLCs）[8]。这类细胞具有成体干细胞的某些功能特征，包括自我增殖和多向分化的能力，称为“干性（stemness）”[9]。研究发现，肿瘤干细胞在放化疗抵抗和肿瘤复发过程中起关键作用[10]，而目前的常规治疗可能并未能有效地清除这些细胞，所以复发也就在所难免[3]。因此深入探讨肿瘤干性与复发胶质瘤的分子机制尤为重要。

miR为在真核细胞生物体中广泛存在的非编码小分子单链RNA，可以参与调控胶质瘤的发生发展，并在其侵袭和转移过程中起促进或抑制作用。因此通过检测各级别胶质瘤组织中miR表达情况，可对其预后的判断提供重要依据。有研究表明miR-200家族成员（miR-200s）在晚期癌症中经常被沉默。在胶质瘤中同样可见miR-200b的低表达[11]。文献[12]报道，miR-200c在人乳腺肿瘤干细胞及非致瘤癌细胞中存在差异性表达，可通过调节干细胞因子BMI1，抑制正常乳腺干细胞分化为乳腺小管，也可以抑制乳腺癌干细胞的成瘤能力。miR-200c下调在乳腺癌细胞中表达肿瘤干细胞标志物，重新表达miR-200可逆转肿瘤标志物的特点[13]。肿瘤标志物表型的主要特点（无黏附力和增加细胞活力的能力）在目前的研究中都被确定为miR-200c的直接调控[14]。本研究结果显示，各组miR-200c表达水平随着胶质瘤级别升高逐渐降低，两组间比较差异均有统计学意义（P<0.05），提示miR-200c在正常脑组织中的表达情况明显高于胶质瘤组织，且miR-200c的表达情况与胶质瘤的级别呈负相关趋势，特别是在复发胶质瘤中其表达经常被沉默。说明了在生长活跃、恶性程度高的胶质瘤中miR-200c水平明显下降。

另一方面，miR不仅能参与调控胶质瘤的发生发展，并对正常胚胎干细胞的自我更新能力以及细胞分化能力起着重要的调节作用。目前越来越多的研究表明，EMT参与肿瘤的侵袭及迁移并与肿瘤细胞的干细胞特征密切相关。EMT通过改变肿瘤的微环境使肿瘤细胞获得干细胞特性[15-18]，并在肿瘤转移、治疗抵抗和再复发中起关键作用[4-5]。同样miR-200家族成员（miR-200s）亦参与了EMT过程。miR-200抑制EMT，上皮细胞获得迁移、侵袭和间质细胞抗凋亡的能力。笔者研究了miR-200c是否调节通过调节EMT过程从而通过影响肿瘤干性调控胶质瘤的发生发展及复发。研究发现，在EMT的过程中伴随着上皮标记分子E-cadherin的下调和间充质标记分子N-cadherin的上调。本研究检测EMT相关分子（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）及肿瘤干性相关分子（NESTIN、CD133）在各组织样本中表达情况，结果显示，高级别胶质瘤组、复发胶质瘤组CD133表达水平均较对照组、低级别胶质瘤组显著升高，且复发胶质瘤组CD133表达水平较高级别胶质瘤组显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）;各组Nestin表达水平随着胶质瘤级别升高逐渐升高，E-cadherin表达水平随着胶质瘤级别升高逐渐降低，两两组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）;高级别胶质瘤组、复发胶质瘤组N-cadherin、Vimentin表达水平均较对照组显著升高（P<0.05），且复发胶质瘤组N-cadherin、Vimentin表达水平均较低级别胶质瘤组、高级别胶质瘤组显著升高（P<0.05）。上述结果与EMT的发生发展过程相关一致，且与本研究中肿瘤干性指标及miR-200c表达趋势相一致，且Siebzehnrubl等[19]指出在胶质瘤和正常脑组织中可出现N-cadherin的明显升高。上述结果提示，复发及高级别胶质瘤Vimentin表达明显增高、E-cadherin表达明显减少，的确有EMT的发生;但在低级别胶质瘤中，相比正常组织，EMT标记分子变化不明显，表明在低级别胶质瘤中EMT不是其侵袭、迁移的主要特征。

综上所述，复发及高级别胶质瘤比起正常组织及低级别胶质瘤，肿瘤细胞干性明显增强，并有明确的EMT发生，且miR-200c表达水平也同各分子表达呈线性相关趋势。证实了miR-200c参与调控了复发及恶性胶质瘤EMT发生，并调控了其肿瘤细胞的干性，这三者紧密联系，可能是胶质瘤复发的重要原因之一。miR-200c一方面可以调控EMT发生，另一方面调控肿瘤细胞的干性，可以认为是EMT和肿瘤干细胞的枢纽调控分子。但对于其中调控的分子机制仍有待进一步的研究，从而寻找一条治疗胶质瘤的新道路。

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（收稿日期：2020-03-05） （本文編辑：董悦）