基于网络药理学方法探讨芍药甘草汤治疗高催乳素血症的潜在作用机制Δ

时萌萌，蔡华丹，马 良，周 坤，付永莉，刘 茜，顾洪伟#

(1.武汉市精神卫生中心/武汉市心理医院药学部，武汉 430000； 2.中国人民解放军总医院第五医学中心药学部，北京 100039)

服用抗精神病药的患者中，高催乳素血症(hyperprolactinemia，HPRL)发生率高达70%[1]。该病可导致性功能障碍、骨密度降低、月经紊乱、乳房发育和溢乳，以及下丘脑-垂体-性腺轴的抑制，还可能使乳腺癌的发生率升高。目前，针对药源性HPRL尚无安全有效的治疗方法，中医认为肝脾肾三脏功能失调导致气血失和为HPRL的基本病机，故中医多从肾、肝、脾三脏着手治疗[2]。芍药甘草汤始载于《伤寒论》，方中芍药味酸、苦、甘，入肝脾二经，具有养血敛阴、柔肝止痛的功效；甘草味甘、性平，归心、肺、脾、肾经，具有补中益气、缓急止痛及调和药性的功效。研究结果证实，芍药甘草汤可治疗HPRL，但尚不明确其作用机制[3-4]。网络药理学作为新兴的技术方法能对中药作用于机体后的多成分、多途径和多靶点进行较为全面地揭示。故本研究采用网络药理学方法，分析、预测芍药甘草汤治疗HPRL的活性成分和作用靶点，以期为后续的基础研究提供科学依据和启示。

1 资料与方法

1.1 芍药甘草汤活性成分及作用靶点的获取

在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库中，以白芍、甘草为关键词，以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18为筛选条件进行检索，检索出芍药甘草汤的活性成分。再次利用TCMSP检索白芍和甘草所有活性成分对应的靶点，在Uniprot数据库中获取靶点对应的靶基因，即芍药甘草汤活性成分作用的靶点。

1.2 HPRL疾病靶点的获取

以“HPRL”和“Hyperprolactinaemia”为关键词，分别通过GeneCards数据库、人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM)数据库、DisGeNET数据库和Drugbank数据库检索并筛选HPRL相关的靶点。

1.3 药物-疾病靶点取交集

为明确芍药甘草汤与HPRL潜在靶点间的相互作用，利用Venny 2.1在线工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取交集靶点，作为芍药甘草汤治疗HPRL的重要靶点。

1.4 芍药甘草汤成分-HPRL靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

把得到的交集靶点上传至STRING 11.0数据库(https://string-db.org/)，将物种设置为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设置为0.4，去除游离的节点，获得PPI网络，并通过Cytoscape 3.7.1软件根据节点度值大小筛选核心靶点。

1.5 药物-成分-靶点-疾病网络构建

运用Cytoscape 3.7.1创建药物-成分-靶点-疾病网络，并利用Network Analyzer插件对点度中心性(DC)、中介中心性(BC)和接近中心性(CC)网络拓扑参数进行分析，判断核心靶点和主要活性成分。

1.6 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

在DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中导入药物与疾病的交集靶点，设置P<0.01，对主要的生物学过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)与代谢通路进行富集分析，按Pvalue升序进行排序，利用微生信软件(http://www.bioinformatics.com.cn/)将通路进行可视化，以柱状图和气泡图形式绘制结果。

1.7 芍药甘草汤活性成分和核心靶点分子对接

从PubChem数据库中下载芍药甘草汤活性成分SDF结构，靶蛋白三维结构从PDB数据库下载获得，使用AutodockTools 1.5.6打开配体小分子和靶蛋白，对其进行加氢、计算电荷、合并非极性氢后，采用Autodock vina 1.1.2进行半柔性对接，分析结合能力。

2 结果

2.1 芍药甘草汤活性成分和作用靶点

以OB≥30%且DL≥0.18为筛选条件，通过TCMSP数据库筛选得到白芍活性成分13种，甘草活性成分92种，重复成分3种，共102种活性成分。同时，删除重复靶点后获得白芍和甘草活性成分对应靶点244个。白芍和甘草部分活性成分基本信息见表1(仅列出其中20项)。

表1 芍药甘草汤部分活性成分Tab 1 Some active ingredients of Shaoyao Gancao decoction

2.2 HPRL疾病靶点

通过检索GeneCards、DisGeNET数据库，分别得到113、48个疾病靶点，以OMIM和DrugBank数据库作为补充，整合并删除重复靶点，最终获取HPRL疾病靶点144个。

2.3 药物与疾病靶点取交集

在Venny 2.1在线工具中输入芍药甘草汤靶点和HPRL相关靶点绘制韦恩图，共取得药物-疾病交集靶点35个，见图1。

图1 芍药甘草汤-HPRL共同靶点韦恩图Fig 1 Venny diagram of the common targets of Shaoyao Gancao decoction-HPRL

2.4 芍药甘草汤成分-HPRL靶点PPI网络的构建

通过STRING 11.0数据库导入韦恩图获得的35个交集靶点，得到芍药甘草汤-HPRL的PPI网络，见图2。该网络共有35个节点，183条边，平均节点度值为10.5，度值排序居前10位的靶点为FOS、雌激素受体1(ESR1)、表皮生长因子(EGF)、受体酪氨酸蛋白激酶2(ERBB2)、G1/S-特异性Cyclin-D1(CCND1)、JUN、孕酮受体(PGR)和白细胞介素(IL)4，上述靶点可能是芍药甘草汤治疗HPRL的关键靶点。

图2 芍药甘草汤-HPRL靶点PPI网络Fig 2 PPI network diagram of Shaoyao Gancao decoction-HPRL

2.5 药物-成分-靶点-疾病网络的构建

在Cytoscape 3.7.1软件上，构建“药物-成分-靶点-疾病”关系网络，见图3；图中，箭头表示疾病，三角形表示药物，菱形表示预测靶点，圆形和六边形表示活性成分，八边形表示共有活性成分。利用Network Analyzer分析网络的拓扑参数，以大于DC、BC和CC的平均值为标准筛选出ESR1、α1B-肾上腺素受体(ADRA1B)和血管内皮生长因子受体2(KDR)等核心靶点，槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、芒柄花黄素(formononetin)、甘草查尔酮A(licochalcone a)和柚皮素(naringenin)等关键有效成分，见表2—3。

图3 芍药甘草汤-成分-靶点-HPRL网络图Fig 3 Network diagram of Shaoyao Gancao decoction-ingredient-target-HPRL

表2 芍药甘草汤治疗HPRL核心靶点拓扑参数Tab 2 Topological parameters of core targets of Shaoyao Gancao decoction in the treatment of HPRL

表3 芍药甘草汤治疗HPRL关键成分拓扑参数Tab 3 Topological parameters of key ingredients of Shaoyao Gancao decoction in the treatment of HPRL

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通过GO富集分析共获取GO条目112个(P<0.05)，其中BP条目82个，CC条目10个，MF条目20个，根据P值大小，可视化分析前10条GO条目，见图4。结果显示，芍药甘草汤主要参与的BP包括药物反应、老化、DNA模板转录的正调控、从RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、胞外信号调节激酶(ERK)1和ERK2级联的正调控、一氧化氮生物合成过程的正调控以及对乙醇的反应等；涉及的CC主要包括线粒体外膜、轴突、质膜的组成部分、核和内质网等；涉及蛋白质异二聚活性、酶结合、相同的蛋白质结合、转录因子结合、受体信号蛋白酪氨酸激酶活性等MF。

图4 GO功能富集分析柱状图Fig 4 Histogram of GO enrichment analysis

KEGG富集分析得到信号通路40条(P<0.05)，分为疾病通路24条，包括各类癌症、肺结核、肝炎和类风湿关节炎等；其他通路16条，包括FoxO、缺氧诱导因子(HIF)1、JAK激酶-信号转导与转录激活子(Jak-STAT)、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)和丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)、催乳素(PRL)信号通路和T细胞受体信号通路等，P值由小到大排序居前25位通路的气泡图见图5。

图5 KEGG通路富集气泡图Fig 5 Enrichment bubble diagram of KEGG pathway

2.7 分子对接结果

以“2.5”项下筛选出来的11个活性化合物分别与核心靶蛋白进行分子对接验证，见图6。对接效能排序居前4位的分别为ADRA1B与shinpterocarpin(MOL004891)、ADRA1B与山柰酚(MOL000422)、ADRA1B与甘草查尔酮A(MOL000497)以及KDR与槲皮素(MOL000098) ，其结合能分别为-42.7、-41.9、-39.8和-38.5 kJ/mol。上述结合模式见图7。

图6 分子对接效能热图Fig 6 Heat map of molecular docking efficiency

图7 分子对接模式图Fig 7 Molecular docking mode diagram

3 讨论

根据中医古籍中的记载，HPRL可归属为“闭经”“月经后期”“乳泣”“崩漏”“不孕”和“经行乳房胀痛”等范畴，中医治疗主要以疏肝解郁、补肾健脾、化湿祛瘀和回乳通经为主。芍药甘草汤有疏肝解郁、安脾缓急之功，益气养血、散瘀通经之效，近年来多项研究结果证实芍药甘草汤具有降低PRL的效用，但发挥效用的有效成分和作用靶点尚不明确。

本研究共筛选出93种芍药甘草汤的活性成分，关键活性成分包括槲皮素、山柰酚、芒柄花黄素、甘草查尔酮A和柚皮素等，上述活性成分可能在芍药甘草汤治疗HPRL的过程中发挥重要作用，表明芍药甘草汤是通过多成分、多靶点、多途径共同发挥作用的。雌激素可促进脑垂体泌乳细胞的形成，并且刺激其分泌和释放PRL[5]。植物雌激素作为“选择性雌激素受体调节剂”可以与ESR1结合，发挥弱的雌激素样或抗雌激素样作用[6-7]。槲皮素、山柰酚、芒柄花黄素和柚皮素均为植物雌激素，当其处于高水平时，可起到抗雌激素的作用，从而降低PRL水平[8-9]。

药物-成分-靶点-疾病网络和PPI网络筛选出ESR1、ADRA1B、KDR、FOS、EGF和ERBB2等多个核心靶点，芍药甘草汤可能通过上述靶点发挥治疗HPRL的作用。下丘脑室旁核(PVN)被认为是PRL调节系统的中枢刺激成分，有实验结果证明，α1B-肾上腺素能受体亚型(ADRA1B)在PVN水平上调节催乳素具有重要作用[10]。体外研究结果表明，所有的肾上腺素受体拮抗剂对ADRA1B的拮抗作用都会使PRL产生剂量依赖性降低[11]。有研究结果表明，小鼠乳腺肌上皮和上皮中血管内皮生长因子(VEGF)的条件性缺失降低了血管密度和功能，严重影响乳汁分泌[12]。KDR可以通过共受体神经纤毛蛋白增强VEGF的作用[13-14]。证明KDR可能参与了PRL的生成过程。本研究结合分子对接技术，进一步验证了芍药甘草汤治疗HPRL的作用机制，其主要活性成分与核心靶点具有较好的结合能力。

KEGG分析结果表明，芍药甘草汤可能通过调控FoxO、HIF-1、PRL、Jak-STAT、PI3K-Akt和MAPK等信号通路发挥治疗HPRL的作用。有研究结果表明，PRL诱导成纤维细胞、白细胞和大鼠C6神经胶质瘤细胞中神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达，nNOS产生的一氧化氮可能是大脑中PRL作用的信使，调节PRL和催产素分泌[15]。PRL受体(PRLR)与PRL结合启动JAK激酶2-信号转导及转录激活因子5(JAK2-STAT5)信号传导通路[16-17]。高PRL环境下，PRL/PRLR-JAK2-STAT5信号通路相关因子表达降低，与该信号通路相关的激素酶级联反应降低，抑制性腺轴功能及性激素的产生[18-19]。丁巧燕等[20]的研究结果表明，回乳抑增方可通过调控PI3K-Akt-mTOR信号通路，抑制催乳素腺瘤的增长和PRL的过度分泌；Tang等[21]的研究结果表明，卡麦角林通过抑制AKT-mTOR信号通路诱导催乳素瘤细胞自噬死亡，控制PRL水平；Romano等[22]发现，PI3K-Akt抑制剂可减弱胰岛素样生长因子刺激的催乳素分泌。结合本研究结果可推测，芍药甘草汤可能通过PI3K-Akt途径治疗HPRL。

本研究以网络药理学方法对芍药甘草汤治疗HPRL的作用机制进行探讨，预测了芍药甘草汤治疗HPRL的主要成分、作用靶点和信号通路，并以分子对接理论验证了预测结果的合理性。但本研究是基于目前公开的数据资料，而数据具有实时性，故本研究具有一定的局限性，尚有待基础和临床研究的进一步验证。